菌核病菌誘導(dǎo)甘藍(lán)型油菜抗病基因表達(dá)差異的分析.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)以抗(耐)菌核病顯著差異的甘藍(lán)型油菜近等基因系(甘藍(lán)型油菜中油821(輪回親本)和中R888×中油821的回交5代所組成的一對近等基因系)為材料，利用cDNA-AFLP技術(shù)尋找菌核病菌誘導(dǎo)后所產(chǎn)生的表達(dá)差異，篩選并初步鑒定了與抗菌核病相關(guān)的差異片斷，為油菜抗菌核病防御反應(yīng)機(jī)理的研究提供線索。本實(shí)驗(yàn)取得的主要結(jié)果如下： 建立了用10×8.5cm小型垂直板電泳展示選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物的體系。在43℃條件下，用小面積變性聚丙烯胺凝膠檢

2、測擴(kuò)增產(chǎn)物，使AFLP更為簡便、經(jīng)濟(jì)，而亦可檢測到可靠、豐富的多態(tài)位點(diǎn)。這將推進(jìn)AFLP技術(shù)更迅速進(jìn)入一般實(shí)驗(yàn)室。用cDNA-AFLP技術(shù)方法分析了甘藍(lán)型油菜近等基因系受菌核病菌侵染后特異表達(dá)條帶。對獲得的20個差異片斷進(jìn)行了驗(yàn)證，得到9個有效片斷，并克隆測序，對測序的結(jié)果進(jìn)行序列相似性分析。并從中選擇兩條序列片斷進(jìn)行了分析。 由差異片段40-2的比對分析結(jié)果推測，其基因表達(dá)產(chǎn)物屬于富含亮氨酸蛋白家族。同源片段克隆得到40-2的

3、延伸序列片斷，在近等基因系中都含有大小相同的帶型。選擇蛋白質(zhì)延伸因子-1α作為內(nèi)參照，進(jìn)行半定量PCR結(jié)果顯示所得序列在近等基因系之間有明顯的模板量差異，即在輪回親本中油821中表達(dá)量明顯較大，在回交后代中表達(dá)量相對較少。Northern雜交的結(jié)果驗(yàn)證該基因片斷在甘藍(lán)型油菜抗(耐)菌核病菌材料中低水平表達(dá)，在感病材料中呈高水平表達(dá)，說明該片斷與甘藍(lán)型油菜抗(耐)菌核病有關(guān)。 對差異片斷18-2進(jìn)行同源片段克隆得到長度約為1260

4、bp左右的延伸序列。ORFfinder推測該序列包含有一個完整的開放閱讀框架，經(jīng)BLAST序列比對分析，該片斷與擬南芥中一未知功能蛋白高度同源。在進(jìn)行同源性分析后發(fā)現(xiàn)此序列在近等基因系之間的同源性僅為89.9％；酶切位點(diǎn)的分析發(fā)現(xiàn)，MseI(在進(jìn)行cDNA-AFLP分析時用EcoRI/MseI限制性內(nèi)切酶組合分別進(jìn)行酶切近等基因系的cDNA)酶切位點(diǎn)發(fā)生的缺失在回交后代中，而中油821中存在此酶切位點(diǎn)。Northern雜交的結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)在