山核桃嫁接過(guò)程中Aux-IAA基因功能研究和小RNA測(cè)序分析.pdf

1、作為山區(qū)農(nóng)民脫貧致富的主要經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，山核桃（Carya cathayensis Sarg.）具有很多困難的問(wèn)題比如童期較長(zhǎng)，不容易采收，樹(shù)體高大以及園藝化栽培等，這就是山核桃的產(chǎn)業(yè)發(fā)展上的巨大難題。但是植物嫁接手段是植物的無(wú)性繁殖里面比較重要的植物栽培技術(shù)，也是解決山核桃優(yōu)良種質(zhì)及園藝栽培的重要手段。并且隨著嫁接的成熟，人們開(kāi)始探討嫁接的機(jī)理問(wèn)題，從而能夠更好地指導(dǎo)嫁接。本研究根據(jù)基因克隆獲得山核桃生長(zhǎng)素原初響應(yīng)基因（CcIAA）片段，

2、采用RACE技術(shù)克隆CcIAA基因的cDNA全長(zhǎng)，同時(shí)進(jìn)行同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，并利用qRT-PCR，Western blot技術(shù)分析了在山核桃嫁接過(guò)程中 CcIAA基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的表達(dá)情況。同時(shí)為了探究小RNA在山核桃的嫁接過(guò)程里面所起到的功能作用，研究了山核桃嫁的接過(guò)程里三個(gè)不同階段（0天，7天和14天）的小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析。主要的研究結(jié)果：
　　1、克隆獲得的CcIAA cDNA從起始的密碼子atg

3、，到終止的密碼子tga一共含有591個(gè)堿基，共編碼196個(gè)氨基酸。CcIAA與17種樹(shù)種的17個(gè)基因進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因與其他植物Aux/IAA基因同源性比較高。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析同樣表明CcIAA與蓖麻RcIAA基因聚為一類(lèi)，說(shuō)明它們的親緣關(guān)系最相近，而與其關(guān)系比較遠(yuǎn)的則是鷹嘴豆CaIAA和菜豆PvIAA。
　　2、利用 qRT-PCR技術(shù)，對(duì)不同激素處理?xiàng)l件下（如空白的對(duì)照，4mg/l IAA和0.3ug/l NPA）不同嫁

4、接時(shí)間段（0d,1d,3d,5d,7d和14d）山核桃CcIAA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果說(shuō)明：對(duì)照組里面，山核桃 CcIAA基因表達(dá)量在砧木和接穗中都是從嫁接前到嫁接后7天都是持續(xù)下降的，并且在7天時(shí)其表達(dá)量幾乎為0，但是到14天其表達(dá)量會(huì)比嫁接前更高。通過(guò)IAA處理的山核桃CcIAA基因表達(dá)量在嫁接后1天會(huì)急劇升高，在隨后的4天里，該基因的表達(dá)量逐漸下降，然后一直到14天，其表達(dá)量都是上升的。砧木和接穗中該基因的表達(dá)趨勢(shì)一致。通過(guò)

5、NPA處理，無(wú)論是接穗還是砧木，山核桃 CcIAA基因表達(dá)量明顯在嫁接之后7天里都是比較低的，到14天明顯升高。用IAA處理過(guò)的山核桃CcIAA基因表達(dá)量和對(duì)照相比是升高的，而用NPA處理過(guò)的山核桃CcIAA基因表達(dá)量和對(duì)照相比也是升高的，但是用IAA處理的表達(dá)量表達(dá)量則升嫁接前期卻沒(méi)有NPA處理后上升明顯。
　　3、利用Western blot技術(shù)，對(duì)不同激素處理?xiàng)l件下（如空白作對(duì)照，4mg/l IAA和0.3ug/l NPA）

6、在不同的嫁接時(shí)間段（0d,1d,3d,5d,7d和14d）山核桃CcIAA蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明：CcIAA蛋白在山核桃嫁接的過(guò)程中表達(dá)量大都是不太相似的。對(duì)照中，不管是砧木還是接穗中，CcIAA的蛋白表達(dá)量在整個(gè)嫁接過(guò)程中都是比較低的，并且到14天時(shí)表達(dá)量明顯增加；而用IAA處理后，山核桃CcIAA蛋白表達(dá)量明顯升高，特別是接穗中的表達(dá)量更高；但是用IAA抑制劑NPA處理之后，和對(duì)照相比，CcIAA蛋白表達(dá)量略有增加，但是和IA

7、A處理對(duì)比，發(fā)現(xiàn)該蛋白在前期明顯受到抑制。
　　4、通過(guò)對(duì)山核桃中三個(gè)sRNA文庫(kù)的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明21個(gè)保守miRNA屬于13個(gè)miRNA基因家族，但是10個(gè)新miRNA和8個(gè)潛在的新miRNA屬于15個(gè)miRNA基因家族。在這些miRNAs中，選取14個(gè)miRNAs包含7個(gè)保守miRNAs和7個(gè)新miRNAs進(jìn)行表達(dá)分析，在山核桃嫁接后7和14天（0天為對(duì)照），除了其中三個(gè)小RNA cca-miRS4，cc

8、a-miRS5和cca-miRS6與Solexa測(cè)序表達(dá)結(jié)果不一致，其余11個(gè)miRNAs都顯示出與Solexa測(cè)序結(jié)果具有相同的表達(dá)趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)小RNA測(cè)序表達(dá)譜中的79％得到驗(yàn)證。另外本研究還預(yù)測(cè)了保守miRNA基因的89個(gè)靶基因和新的 miRNA基因的26個(gè)靶基因。選取四個(gè) miRNA靶基因（cca-miR156，cca-miR159，cca-miR390和cca-miR827）進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果表明miRNAs與其相關(guān)