豬水腫病菌毒素A亞單位（SLT-ⅡeA）單抗的制備及SLT-ⅡeA與F18ab菌毛A亞單位的聯(lián)合表達.pdf

1、該研究制備獲得了針對SLT-ⅡeA亞單位的單克隆抗體,利用實驗室現(xiàn)有的SLT-ⅡeA亞單位重組表達菌pSLT-ⅡeA在2×YTA培養(yǎng)后,經IPTG誘導表達融合蛋白GST-SLT-ⅡeA,經谷胱苷肽活化的Sepharose 4B親和層析柱提純后測定濃度,作為免疫原免疫BALB/c小鼠.經誘導表達融合蛋白的重組菌、未經誘導不表達融合蛋白的重組菌及僅表達載體蛋白GST的重組菌三者的裂解產物包被ELISA板,細胞融合后培養(yǎng)基上清經檢測獲得1株針

2、對SLT-Ⅱe A亞單位的雜交瘤細胞,命名為A<,2>-D<,3>,制備的單抗腹水ELISA效價為24log2,免疫印跡結果表明此單抗僅與融合蛋白反應,而與載體蛋白不反應.利用此單抗經Western-blotting檢測13個水腫病菌株,發(fā)現(xiàn)均產生志賀樣毒素Ⅱ型變異體.用PCR技術對F107/86標準株擴增F18ab菌毛主要亞單位A(FedA)的510bp的基因序列(fedA),并將PCR擴增片段在EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點克隆進p

3、GEX-6P-1質粒載體,獲得重組質粒pE107,將此質粒轉化大腸桿菌BL21,誘導表達融合蛋白GST-F107.利用EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點將SLT-ⅡeA基因序列從已有的重組表達質粒pSLT-ⅡeA中切出亞克隆入pF107下游,獲得重組表達質粒pFSLT-ⅡeA,轉化大腸桿菌BL21,用IPTG進行誘導表達,通過對重組大腸桿菌pFSLT-ⅡeA的菌體裂解物的SDS-PAGE電泳分析及Western-blotting鑒定,表明重組