豬源糞腸球菌Ebp菌毛亞單位蛋白的免疫作用研究.pdf

1、腸球菌可引起豬等多種動物和人發(fā)病，由于具有天然和獲得性抗性能力，腸球菌對現(xiàn)有的抗生素均產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，且可通過質(zhì)?；蚧蜣D(zhuǎn)移的方式，將抗生素尤其是萬古霉素抗性基因通過食物鏈由動物傳播給人，或在其他細(xì)菌之間傳遞，這使得腸球菌感染的預(yù)防和治療變得尤為重要。
　　腸球菌的致病主要是通過黏附、侵襲和機體損傷，其中黏附是疾病感染發(fā)生的關(guān)鍵一步。菌毛是細(xì)菌的表面黏附結(jié)構(gòu)，菌體借助菌毛可牢固黏附在腸道上皮細(xì)胞及胞外基質(zhì)，進而侵入到宿主機

2、體內(nèi)部，激發(fā)組織損傷，而且，ebp菌毛基因在動物源性糞腸球菌中分布廣泛且高度保守，因此，研究其Ebp菌毛蛋白尤其是亞單位蛋白抗黏附、抗侵襲、抗吞噬、抗生物被膜生成以及對機體的免疫保護作用就成為預(yù)防和治療腸球菌的關(guān)鍵。本試驗利用已構(gòu)建的豬源糞腸球菌重組亞單位蛋白EbpA、EbpB和EbpC等片段，免疫制備兔抗血清，通過重組亞單位蛋白Ebp片段的多抗血清對糞腸球菌生物被膜形成、黏附侵襲腸上皮細(xì)胞和逃逸小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響及蛋白免疫

3、保護作用進行研究，希望能對腸球菌的致病機理、預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。
　　對生物被膜形成的影響作用生物被膜是細(xì)菌抵抗外界不良環(huán)境影響的生物屏障。本試驗利用生物被膜體外定量檢測方法對糞腸球菌在不同環(huán)境（培養(yǎng)時間，培養(yǎng)基類型）下產(chǎn)生生物被膜的差異進行探究，在最適條件下用多克隆抗血清及純化IgG與糞腸球菌N9、N41作用，比較其生物被膜形成量的變化。結(jié)果表明多抗血清EbpA1對糞腸球菌N41的生物被膜形成有明顯阻斷作用（P＜0.05）；

4、多抗IgG EbpA1、EbpA3和EbpC1對糞腸球菌生物被膜的形成均有明顯阻斷作用（P＜0.05），其中EbpA1的阻斷作用最強，其次是EbpC1。
　　對黏附侵襲豬腸道上皮細(xì)胞的影響作用細(xì)菌主要通過黏附侵襲和機體損傷感染導(dǎo)致疾病發(fā)生。本試驗將多抗血清及其純化IgG分別與糞腸球菌N9、N41在37℃下孵育后，感染細(xì)胞，觀察其對細(xì)菌黏附侵襲細(xì)胞能力的影響。結(jié)果顯示N41菌株的黏附侵襲率高于N9菌株(P＜0.01)。菌毛蛋白多抗E

5、bpA1及EbpC1對試驗菌株的黏附侵襲阻斷能力最強，且分別與陰性對照組、空白對照組細(xì)菌的黏附侵襲率有明顯差異（P＜0.05）。
　　對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬殺菌作用的影響本試驗將N9、N41菌株與試驗組血清（未滅活EbpA1和EbpC1蛋白多抗血清）、對照組血清（滅活EbpA1、EbpB1和EbpC1蛋白多抗血清）作用后，感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)3h、6h、24h、48h和72h，通過BHI瓊脂平板計數(shù)觀察巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌的CF

6、U變化，以明確糞腸球菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活情況。同時檢測吞菌后巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ、IL-6和TNF-α含量的變化。結(jié)果顯示試驗組、對照組和空白對照組的菌株感染巨噬細(xì)胞，3h時巨噬細(xì)胞吞噬糞腸球菌的CFU最多，6h時巨噬細(xì)胞吞噬糞腸球菌的CFU大量減少，3h到6h時間段內(nèi)巨噬細(xì)胞對菌株的殺菌作用最強（P＜0.01），3h時試驗組血清EbpA1和EbpC1、對照組血清EbpA1和EbpC1分別與細(xì)菌作用后，感染巨噬細(xì)胞，結(jié)果試驗組

7、細(xì)菌的CFU小于對照組細(xì)菌的CFU（P＜0.01），對照組菌株的CFU大于空白對照組菌株的CFU（P＜0.05）。72h時N9、N41菌株的CFU約為3h時菌株CFU的4％、13%，說明部分糞腸球菌可以逃逸小鼠巨噬細(xì)胞的殺傷。細(xì)胞因子測定結(jié)果顯示，對照組血清EbpA1與糞腸球菌N9和N41作用后感染巨噬細(xì)胞，細(xì)胞因子IFN-γ、IL-6、TNF-α的分泌量分別是空白對照組菌株N9和N41的2.08倍（P＜0.001）和1.95倍（P＜0

8、.001）、1.75倍（P＜0.01）和1.23倍、1.63倍（P＜0.05）和1.25倍；EbpC1與糞腸球菌N9和N41作用后感染巨噬細(xì)胞，細(xì)胞因子IFN-γ、IL-6、TNF-α的分泌量分別是空白對照組菌株N9和N41的1.97倍（P＜0.001）和1.87倍（P＜0.001）、1.63倍（P＜0.01）和1.14倍、1.45倍和1.13倍。表明與對照組滅活血清EbpA1和EbpC1作用后的菌株感染巨噬細(xì)胞，能使其發(fā)生更強烈的免疫

9、反應(yīng)而促使炎癥因子分泌的增加。
　　動物攻毒保護性研究小鼠免疫重組亞單位蛋白EbpA1、EbpB1和EbpC1后，進行全血調(diào)理吞噬試驗和攻菌保護試驗。結(jié)果顯示，EbpA1免疫小鼠的全血殺菌能力最強，其次是EbpC1。EbpA1、EbpC1免疫小鼠的全血殺N9和N41菌株后存活的CFU分別是空白對照存活菌株N9和N41CFU的0.24倍（P＜0.05）和0.32倍（P＜0.05）、0.29倍（P＜0.05）和0.36倍（P＜0.05