動物源性糞腸球菌ebp菌毛基因的保守性及其多克隆抗體的制備.pdf

1、糞腸球菌是醫(yī)院內和動物感染的重要病原體，對人、畜健康和食品安全構成嚴重的威脅。一般認為腸道表皮屏障是細菌性病原體侵入的優(yōu)先入口，黏附并定植到腸上皮細胞是其感染的關鍵步驟。菌毛在革蘭氏陰性和陽性細菌的感染中起著關鍵的作用，但動物源性糞腸球菌ebp菌毛基因的攜帶情況、保守性以及它的致病作用還不清楚。本研究通過對動物源性糞腸球菌的ebp基因分布情況、保守性進行分析，并原核表達ebp菌毛蛋白，制備高效價、高特異性的多克隆抗體，以分析其致病作用和

2、免疫原性，從而為動物源性糞腸球菌感染的預防和治療打下良好的基礎。
　　使用Nallapareddy等人所描述的引物，采用PCR方法對2006年至2011年間從河南省不同地區(qū)分離的50株動物源性糞腸球菌ebp基因的攜帶情況進行檢測，結果顯示50株動物源性糞腸球菌全部攜帶ebpABC基因。再根據GenBank上已發(fā)表的糞腸球菌OG1RF株的ebp基因序列，使用Primer Premier5.0設計ebpABC全基因引物，對10株動物源

3、性糞腸球菌ebp菌毛蛋白的編碼基因進行PCR擴增，產物經膠回收試劑盒純化回收，與pMD18-T載體連接，轉化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆進行測序。然后應用DNASTAR（5.0版本）軟件將測定出的10株動物源性糞腸球菌的ebp基因序列進行比對分析，并與糞腸球菌OG1RF株的ebp基因序列進行比較，結果顯示測定的10株動物源性糞腸球菌之間ebpA、ebpB和ebpC基因DNA序列的同源性分別為98.0％-100%、98.8

4、%-100%和99.0%-100%，所推導的氨基酸序列的同源性分別為98.4%-100%、98.2%-100%和98.7%-100%。10株菌與GenBank上已發(fā)表的人臨床糞腸球菌OG1RF株相比，ebp基因DNA序列的同源性為98.2%-99.7%，所推導的氨基酸序列的同源性為98.5%-99.8%。由此可見，ebp基因在動物源性糞腸球菌中廣泛分布且高度保守，并且與人源糞腸球菌的同源性也較高。
　　使用生物信息學軟件對糞腸球菌

5、EbpA蛋白和EbpC蛋白的抗原表位進行預測，綜合各軟件的分析結果后將ebpA基因分成3段來表達，分別命名為ebpA1、ebpA2和ebpA3，將ebpC基因分成2段來表達，分別命名為ebpC1和ebpC2。然后，根據GenBank上已發(fā)表的糞腸球菌OG1RF株的ebpA和ebpC基因序列，設計5對帶有合適酶切位點的引物，以提取的豬源糞腸球菌N9株的基因組DNA為模板分別擴增出ebpA1、ebpA2、ebpA3、ebpC1和ebpC2基

6、因片段，大小分別為1167 bp、1098 bp、963 bp、981 bp和891 bp，擴增ebpB基因（ EF1092A）所使用的引物引用Jouko Sillanpaa等人所描述的（酶切位點有改動），目的片段大小為1233 bp。將所擴增出的6個基因片段分別克隆到原核表達載體pET-28a中，構建了重組表達質粒pET-28a-ebpA1、pET-28a-ebpA2、pET-28a-ebpA3、pET-28a-ebpC1、pET-2

7、8a-ebpC2和pET-28a-EF1092A（ebpB），經測序驗證6個重組質粒均構建成功。將重組質粒轉化到表達菌大腸桿菌BL21(DE3)中，在IPTG的誘導下均成功表達，獲得了分子量大小分別約為46.7 kDa、45.0 kDa、39.4 kDa、39.3 kDa、36.0 kDa和50.0 kDa的重組蛋白，與預期的目的蛋白分子量相符。通過優(yōu)化表達條件，大量表達重組蛋白，用尿素法和鎳柱對表達的蛋白進行純化獲得了高純度的重組蛋白

8、。
　　使用6種已純化的重組蛋白作為免疫原分別免疫新西蘭大白兔，制備抗重組蛋白的多克隆抗體，經雙向免疫瓊脂擴散實驗檢測抗體效價分別為1:16、1:8、1:32、1:32、1:64和1:64。將多克隆抗體進行免疫印跡，結果顯示制備的多抗可以與各自的重組蛋白特異性結合。而且，在多克隆抗體阻止野生菌株的生物膜生成實驗中，當抗EbpA3蛋白IgG的終濃度為0.1875 mg/mL時，糞腸球菌N9株的生物膜生成量最少，此數值與陰性對照值差異