s-lap與凋亡相關(guān)性的研究及其多克隆抗體的制備.pdf

1、s-lap是本實驗室利用mRNA差異顯示技術(shù)在可見光誘導(dǎo)的凋亡早期的豬視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞中克隆的一個新的基因，GenBank登錄號為AF509472。s-lap基因具有一個開放閱讀框架，可編碼101個氨基酸。因為s-lap基因的mRNA只表達在可見光損傷的RPE細胞，而在正常的RPE細胞中則不表達，因此我們推測該基因與可見光所致的RPE細胞損傷具有密切關(guān)系，但對s-lap的作用及機制尚不清楚。 本研究首先構(gòu)建了pcDN

2、A3.1/s-lap/GFP真核表達載體，并通過轉(zhuǎn)染四種哺乳動物細胞來觀察s-lap蛋白的細胞內(nèi)定位，結(jié)果表明s-lap蛋白分布在整個細胞，但以細胞核表達為主，提示s-lap可能在細胞核內(nèi)發(fā)揮作用。 因為s-lap是在光損傷的凋亡早期的RPE細胞中表達的一個基因，所以我們進一步對s-lap的超表達與細胞凋亡之間的相關(guān)性進行了研究。雖然基因組電泳結(jié)果顯示在超表達s-lap基因的293T細胞中沒有出現(xiàn)標志細胞凋亡的DNA梯狀帶，但超

3、表達s-lap基因后的細胞周期檢測結(jié)果卻表明，s-lap/GFP融合蛋白可使293T細胞周期發(fā)生明顯的改變，可使G2/M期明顯阻滯。推測s-lap基因可能通過影響細胞周期來參與細胞凋亡的過程。 為了進一步研究s-lap蛋白的組織分布及其功能，制備抗s-lap抗體是十分重要的。因此我們構(gòu)建了pET-28a(+)/s-lap原核表達載體，并在大腸桿菌BL21中通過IPTG誘導(dǎo)表達，然后利用Ni2+柱進行親和層析對重組蛋白進行純化。用