沙丁胺醇多克隆抗體的制備及其在動物源性食品殘留檢測中的應(yīng)用.pdf

1、食品是人類賴以生存和發(fā)展的最基本的物質(zhì)條件，食品安全直接關(guān)系到人類的健康。隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化和食品貿(mào)易的國際化，食品安全已經(jīng)成為一個重要的公共衛(wèi)生問題。動物源性食品中的獸藥殘留也與人類的健康息息相關(guān)。近年來，沙丁胺醇等β2-受體激動劑的非法使用對人體健康造成很大的威脅。由于動物源性食品中獸藥殘留品種多、化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)各異、濃度低、樣品基質(zhì)復(fù)雜、干擾物質(zhì)多，其分離純化已成為獸藥殘留分析技術(shù)中的重點(diǎn)和技術(shù)瓶頸。因此，研究和開發(fā)新的樣品分離、

2、純化和檢測技術(shù)成為獸藥殘留分析領(lǐng)域中的關(guān)鍵技術(shù)。本文采用生物化學(xué)手段，制備沙丁胺醇多克隆抗體，結(jié)合高效液相色譜(HPIC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)等現(xiàn)代儀器分析手段，研究并建立了動物源性食品中痕量獸藥殘留的分離、純化和檢測技術(shù)，所建立的方法對于控制動物養(yǎng)殖中沙丁胺醇的非法使用和保障食品安全都具有重要的意義。
　　 本研究采用對氨基苯甲酸方法(ABA法)和N，N'-羰基二咪唑法(CDI法)合成沙丁胺醇半抗原，再

3、與陽離子化牛血清白蛋白(cBSA)進(jìn)行偶聯(lián)，分別制得免疫原SAL-ABA-cBSA和SAL-CDI-cBSA，用雞卵清蛋白(OVA)分別制備包被抗原SAL-ABA-OVA和SAL-CDI-OVA，并用兩種免疫原對動物進(jìn)行免疫以獲得沙丁胺醇抗體，采用辛酸硫酸銨法純化沙丁胺醇多克隆抗體，用抗體包被固相載體，建立了沙丁胺醇的間接競爭酶聯(lián)免疫測定方法(IC-ELISA)。并將純化的抗體與溴化氰活化的4％瓊脂糖凝膠(Sepharose-4B)偶聯(lián)

4、，制備沙丁胺醇免疫親和柱(IAC)，作為樣品的凈化和分離手段，與HPLC、HPLC-MS/MS、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)結(jié)合，用于動物源性食品中沙丁胺醇的殘留檢測，考察了HPLC-MS/MS和GC-MS法測定沙丁胺醇的基質(zhì)效應(yīng)，取得了如下研究結(jié)果：
　　 ①制備了特異性的多克隆抗體。采用ABA和CDI兩種方法成功合成了沙丁胺醇的人工抗原SAL-ABA-cBSA和SAL-CDI-cB

5、SA，包被原SAL-ABA-OVA和SAL-CDI-OVA，經(jīng)過與兔子免疫，獲得兩種方法的多克隆抗體，其抗體的效價(jià)分別為1:20000和1:15000。ABA法合成的免疫原能夠用于ELISA試劑盒和免疫親和柱的制備；應(yīng)用SAL-ABA-cBSA免疫制備的多克隆抗體與沙丁胺醇、特布他林和克倫特羅均有較好的交叉反應(yīng)，交叉反應(yīng)率分別為100％、100％和205％，對沙丁胺醇和特布他林的IC50均為2.05 ng/mL，對克倫特羅為1.0 ng

6、/mL；應(yīng)用SAL-CDI-cBSA免疫制備的多克隆抗體與沙丁胺醇、特布他林和克倫特羅的交叉反應(yīng)分別為100％、72％和15％，對三種獸藥的IC50分別為18.5 ng/mL、25.6 ng/mL和120ng/mL；
　　 ②建立了高靈敏度的沙丁胺醇酶聯(lián)免疫測定方法。根據(jù)不同稀釋倍數(shù)的多抗血清吸光度值，取OD值1.0左右，包被抗原的最適稀釋比為1:4000，濃度為0.4μg/mL；羊抗兔酶標(biāo)二抗的稀釋比為1:7500，通過間接E

7、LISA法測得血清的最適稀釋比為1:250。IC-ELISA檢測沙丁胺醇的IC50為1.1 ng/mL，最低檢出限為0.1ng/mL，沙丁胺醇加標(biāo)濃度為0～8.1 ng/mL時(shí)，回收率為70±10％，適用于豬尿中沙丁胺醇的快速篩測，其靈敏度比目前商品化試劑盒提高了3～5倍；
　　 ③制備了高性能的沙丁胺醇免疫親和柱：柱容量為400 ng/g基質(zhì)，偶聯(lián)率為98.6％，具有良好的特異性，能夠重復(fù)使用6次以上；
　　 ④采用免

8、疫親和柱凈化/液相色譜法，建立了動物源性食品中沙丁胺醇的簡便、快速和靈敏測定方法。該法的檢出限為0.25 ng/g，最低定量限為0.5 ng/g，靈敏度比現(xiàn)有方法提高2倍以上。平均回收率為87.4～94.6％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10％；
　　 ⑤采用免疫親和柱凈化/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立了動物源性食品中沙丁胺醇的簡便、快速和靈敏的測定方法。該法測得豬肝中沙丁胺醇的CCα和CCβ分別為0.018 ng/g和0.050 ng/g；