EDTA聯(lián)合洗必泰對糞腸球菌抗菌作用的體外研究.pdf

1、目的：糞腸球菌普遍具有形成生物膜的能力，根管內(nèi)的糞腸球菌主要以生物膜形式存在。糞腸球菌生物膜形成后對抗生素具有更強的抵抗性。乙二胺四乙酸(EDTA)是一種金屬螫合劑，EDTA作為常用的根管沖洗液被眾多研究者廣泛關(guān)注。最新研究證明EDTA具有一定的抗菌及抗生物膜的活性，可與多種抗生素聯(lián)合使用達到協(xié)同抗菌和有效清除細(xì)菌生物膜的目的[1-5]。洗必泰又稱醋酸氯已定，一種廣譜抗生素，也是臨床上常用的根管沖洗液。本實驗研究通過在體外環(huán)境下檢測ED

2、TA聯(lián)合洗必泰對糞腸球菌及其生物膜的抗菌效果及清除效果，評價二者是否具有協(xié)同抗菌和清除生物膜作用，旨在為臨床上更加有效地控制糞腸球菌感染，提高根管治療成功率提供理論依據(jù)。
　　方法：⑴采用二倍稀釋法分別測定EDTA、洗必泰對糞腸球菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)，然后采用微量棋盤稀釋法[6]并通過計算分級抑制濃度指數(shù)(FICI)來評價EDTA與洗必泰是否具有協(xié)同抗菌的作用。FICI=(MICa聯(lián)合/MICa單藥)

3、+(MICb聯(lián)合/MICb單藥)。FICI≤0.5為協(xié)同;FICI＞4.0為拮抗;0.5＜ FICI≤4為相加。⑵在96孔板上建立糞腸球菌24h成熟生物膜模型。用BHI培養(yǎng)基把17％EDTA溶液稀釋成6種不同濃度并分6組，A1組(1MIC EDTA)、B1組(2MICEDTA)、 C1組(4MIC EDTA)、D1組(8MIC EDTA)、E1組(16 MIC EDTA)、F1組(32 MIC EDTA)，設(shè)G1組為陰性對照組，采用MT

4、T法檢測各組作用24小時糞腸球菌生物膜后的吸光度值，比較各組之間的差異。不同濃度EDTA聯(lián)合洗必泰分為6組，A2組（1MIC EDTA+0.002％洗必泰）、B2組(2MICEDTA+0.002％洗必泰)、C2組(4MIC EDTA+0.002％洗必泰)、D2組(8MICEDTA+0.002％洗必泰)、E2組（16MIC EDTA+0.002洗必泰）、F2組(32MICEDTA+0.002洗必泰)，設(shè)G2組為陽性對照組（BHI培養(yǎng)基+0

5、.002％洗必泰）、H2組為陰性對照組（BHI培養(yǎng)），采用MTT法檢測各組作用24小時糞腸球菌生物膜后的吸光度值，比較各組之間的差異。⑶在蓋玻片上建立糞腸球菌24h成熟生物膜模型，生物膜分別經(jīng)EDTA、洗必泰或二者聯(lián)合作用24h后，經(jīng)熒光染色后置于激光共聚焦顯微鏡(CLSM)下觀察生物膜中細(xì)菌染色情況及細(xì)菌數(shù)量變化。設(shè)陰性對照組。
　　結(jié)果：①EDTA的MIC值為5.3125mg/ml。MBC值暫未測到。洗必泰的MIC值為0.00

6、125mg/ml，MBC值為0.005mg/ml。經(jīng)微量棋盤測定法測的EDTA聯(lián)合洗必泰的最小抑菌濃度:EDTA（聯(lián)合）濃度為1.328125 mg/ml，洗必泰（聯(lián)合）濃度為4.88×107 mg/ml， FICI值為0.250976。②經(jīng)藥物作用24小時糞腸球菌生物膜后的吸光度值中，A1、B1、C1、D1、E1、F1和G1組7組之間差異無顯著性(P＞0.05);聯(lián)合用藥各組（A2組、B2組、C2組、D2組、E2組、F2組）與G2組（

7、陽性對照組）比較差異有顯著性(P＜0.05)，與H2（陰性對照組）比較差異有顯著性(P＜0.05)，而A2、B2、C2、D2、E2、F2各組之間差異無顯著性(P＞0.05)。③激光共聚焦顯微鏡(CLSM)圖像顯示:EDTA組于CLSM下可見生物膜中細(xì)菌密集，鏡下視野中菌體染色以綠色熒光為主，僅少量菌體染色為紅色熒光，同一視野疊加后，以綠色熒光為主（圖10）;洗必泰組于CLSM下可見生物膜中細(xì)菌數(shù)量減少，鏡下視野中菌體染色呈綠色熒光者比例

8、減少，而紅色熒光比例增加，圖像疊加后呈現(xiàn)黃色或桔色，部分區(qū)域為深紅色（圖11）;EDTA聯(lián)合洗必泰組，生物膜中細(xì)菌數(shù)量減少，鏡下視野中絕大多數(shù)為呈紅色熒光染色的菌體，僅有少量綠色熒光菌體呈零星散在分布，圖像疊加后絕大多數(shù)為紅色熒光染色菌體（圖12）;陰性對照組可見成熟生物膜細(xì)菌密集、層疊，鏡下視野中菌體染色以綠色熒光染色者占絕大多數(shù)，圖像疊加后以綠色熒光為主。
　　結(jié)論：⑴EDTA對糞腸球菌具有一定的抑菌作用，而無殺菌作用。⑵ED