28030.利用crisprcas9技術(shù)構(gòu)建msx1基因敲除人胚胎干細胞系

1、分類號：分類號：密級：密級：UDCUDC：學號：學號：406531514646南昌大學碩士研究生學位論文利用利用CRISPRCas9技術(shù)構(gòu)建技術(shù)構(gòu)建MSX1基因敲除人胚胎基因敲除人胚胎干細胞系干細胞系EstablishmentofMSX1GeneKnockoutHumanEmbryonicStemCelllinesbyCRISPRCas9Technology朱明會培養(yǎng)單位（院、系）：南昌大學附屬口腔醫(yī)院指導(dǎo)教師姓名、職稱：連文偉主任醫(yī)師

2、副教授申請學位的學科門類：醫(yī)學碩士學科專業(yè)名稱：口腔醫(yī)學（修復(fù)）論文答辯日期：2017年6月2日答辯委員會主席：評閱人：2017年6月摘要II摘要目的：目的：1.采用CRISPRCas9基因編輯技術(shù)，構(gòu)建與牙齒發(fā)育相關(guān)的MSX1基因敲除人胚胎干細胞（hESc）穩(wěn)定細胞系。2.研究MSX1基因敲除hESc系的多能性。3.探討MSX1基因敲除hESc的擬胚體（EB）向外、中、內(nèi)三胚層細胞分化的能力。方法方法：1.采用分子克隆的技術(shù)構(gòu)建pX3

3、30MSX1KOsgRNA載體、MSX1基因同源重組敲除載體(don)。2.將pX330MSX1KOsgRNA載體以及don共同電轉(zhuǎn)入hESc，PCR檢測和測序鑒定鑒定存活的克隆。3.對細胞進行形態(tài)學觀察、染色體核型分析、流式細胞術(shù)，檢測MSX1基因雙敲除hESc（H1MSX1DKO）的多能性。4.體外形成H1MSX1DKO的擬胚體（EB），并誘導(dǎo)EB向外、中、內(nèi)三胚層細胞分化，收集EB分化前后（D0和D8）細胞的總RNA，采用實時熒光

4、定量PCR法檢測各組細胞三胚層細胞標記物的表達情況。結(jié)果：結(jié)果：1.質(zhì)粒測序結(jié)果顯示pX330MSX1KOsgRNA載體以及don成功構(gòu)建，并成功獲得78株MSX1基因單敲除和2株MSX1基因雙敲除hESc系（H1MSX1SKOH1MSX1DKO）。2.MSX1基因敲除hESc表現(xiàn)出典型的人胚胎干細胞的形態(tài)；另外，細胞除了保持原有正常核型外，還高表達多能性標記物OCT4和SSEA4。3.實時熒光定量PCR結(jié)果顯示分化D8的細胞外、中、內(nèi)