番茄線粒體小分子熱激蛋白基因啟動(dòng)子的分子克隆.pdf

1、該研究工作主要包括以下三個(gè)部分:第一部分:用番茄MT sHSP cDNA(LeHSP23.8)內(nèi)部特異引物gMT/F、gMT/R,對(duì)番茄(Lycopersicon esc μ llentum)中疏四號(hào)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物連入T載體測(cè)序,發(fā)現(xiàn)基因內(nèi)部有245bp內(nèi)含子.第二部分:用位于番茄MT sHSP cDNA下游的單一酶切位點(diǎn)EcoR Ⅰ,與能克隆入pBS Ⅱ(KS+)的8種酶(BamHⅠ、Bgl Ⅱ、Kpn Ⅰ、Pst

2、Ⅰ、Sac Ⅰ、Spe Ⅰ、Xba Ⅰ、Xho Ⅰ)分別雙酶切番茄"中蔬4號(hào)"基因組DNA,以含有內(nèi)含子的Mt sHSP基因片段為探針做Southern雜交;根據(jù)Southern雜交結(jié)果,預(yù)測(cè)MT sHSP基因上游調(diào)控區(qū)物理圖譜.結(jié)果顯示,Kpn Ⅰ與EcoR Ⅰ雙酶切的基因組DNA的雜交片段約3Kb,包括2Kb左右的上游調(diào)控序列,適合于建質(zhì)粒文庫(kù).因此,回收Kpn Ⅰ與EcoR Ⅰ雙酶切的基因組DNA 3Kb左右的片段,連入同樣酶切的

3、pBSⅡ KS+載體中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài),復(fù)蘇后搖菌,提取質(zhì)粒,因而建成含有MT sHSP基因上游調(diào)控區(qū)2Kb左右的質(zhì)粒文庫(kù).用巢式PCR方法對(duì)質(zhì)粒文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增,得到的片段進(jìn)行序列測(cè)定,從而克隆出MT sHSP基因起始密碼子上游1915bp的上游調(diào)控序列,包括了MT sHSP基因起始密碼子上游的5'UTR區(qū).在PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索我們分離到的MT sHSP基因啟動(dòng)子后,發(fā)現(xiàn)在啟動(dòng)子序列中除了TATA-box、CAAT外,還有

4、典型的熱激蛋白調(diào)控所必需的熱休克元件HSE以及其它一些與脅迫反應(yīng)有關(guān)的元件ABRE、C-repeat_DRE、TCA-element、AP-1等.第三部分:為了檢測(cè)MT sHSP基因上游調(diào)控區(qū)的活性,將克隆的1.9Kb全長(zhǎng)調(diào)控區(qū)構(gòu)建入植物表達(dá)載體pBl121中,得到由MT sHSP基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)的TMP-pBI重組表達(dá)載體.然后將TMP-pBI重組質(zhì)粒用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,利用葉圓盤法對(duì)番茄進(jìn)行Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化,同時(shí)以