過量表達(dá)大分子熱激蛋白HSP84對(duì)煙草抗逆性的影響.pdf

1、HSP90家族是一類高度保守的組成型蛋白,非應(yīng)激條件下含量豐富,約占整個(gè)細(xì)胞內(nèi)蛋白的1-2﹪,應(yīng)激會(huì)增加它的表達(dá)量.H SP90家族在體內(nèi)多為二聚體,由三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域組成:N-末端能夠結(jié)合ATP,C-末端能夠促進(jìn)二聚化并結(jié)合多種輔助伴侶分子,中間鏈接區(qū)具有ATPase活性且能夠結(jié)合各種客戶蛋白.單體的HSP90不具備生物活性功能. HSP90家族是一類特異的ATP依賴性的分子伴侶,能夠活化和調(diào)節(jié)多種涉及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)的蛋白.早

2、期認(rèn)為它可協(xié)助變性蛋白從高溫或其它應(yīng)激環(huán)境中復(fù)性.近年來的研究顯示HSP90家族具有廣泛的生理功能,參與調(diào)節(jié)多種蛋白質(zhì)在非應(yīng)激條件下的生物活性,其中包括調(diào)節(jié)DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄,亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移,細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答、以及生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡等. 從番茄cDNA文庫中克隆到的Leap84位于染色體中,全長(zhǎng)2588bp,表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)中.序列分析證明LeHSP84是HSP90家族的一員.本實(shí)驗(yàn)將Lehsp84基因定向克隆于帶

3、有組成性表達(dá)啟動(dòng)子CaMV35S和NPTⅡ基因(帶有卡那霉素抗性基因)的植物表達(dá)載體pROKⅡ中,凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404,利用葉圓盤法對(duì)煙草進(jìn)行Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化.用含卡那霉素的培養(yǎng)基篩選抗性苗.分別提取轉(zhuǎn)基因煙草葉片基因組DNA、RNA,PCR結(jié)果表明hsp84基因已整合進(jìn)煙草基因組中;Northern blot結(jié)果證明HSP84為組成型表達(dá)且轉(zhuǎn)基因使得表達(dá)量明顯增加. 1)PCR及Northern Blot:PCR

4、結(jié)果顯示轉(zhuǎn)Lehsp84基因的煙草葉片DNA序列用NPTⅡ引物能擴(kuò)增特異DNA片段,而對(duì)照煙草未見特異條帶,說明Lehsp84基因確實(shí)已導(dǎo)入煙草中.Northern blm結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草常溫下HSP84表達(dá)量要高于對(duì)照,說明外源Lehsp84基因已經(jīng)在植物體內(nèi)得以表達(dá). 2)煙草耐熱性:將對(duì)照及轉(zhuǎn)基因煙草植株置于48℃下熱激處理6h,28℃恢復(fù)10-20天,觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Leap84基因煙草生長(zhǎng)良好,而對(duì)照煙草生長(zhǎng)明顯受到抑制.5

5、0℃處理后對(duì)照煙草和大部分轉(zhuǎn)基因煙草很快死亡,仍有部分轉(zhuǎn)基因煙草能萌發(fā)幼芽.熱激后對(duì)照煙草的葉綠素含量要明顯低于轉(zhuǎn)基因煙草.表明過量表達(dá)HSP84可提高煙草的抗熱性.3)轉(zhuǎn)基因煙草抗鹽性:將對(duì)照及轉(zhuǎn)基因煙草用100mmol/LNaCI和150mmol/LNaCl處理7-8天,測(cè)定葉片中MDA含量和SOD酶活性.結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因植株MDA含量要低于對(duì)照植株,SOD活性要高于對(duì)照,但差異不顯著.各種鹽濃度處理轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照煙草在生長(zhǎng)表型上