11425.自制無血清培養(yǎng)體系長期培養(yǎng)對hescs“干性”維持和notch1表達(dá)的影響

1、分類號：密級：UDC：學(xué)號：406520511074南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院碩士研究生學(xué)位論文自制無血清培養(yǎng)體系長期培養(yǎng)對自制無血清培養(yǎng)體系長期培養(yǎng)對hESCs“干性干性”維持和維持和notch1表達(dá)的影響表達(dá)的影響PersistentstemnesssofhESCsnotch1expressionchangesinaselfmadeserumfreemedium彭婷培養(yǎng)單位（院、系）：南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院指導(dǎo)教師姓名、職稱：李劍教授申請學(xué)位的學(xué)

2、科門類：醫(yī)學(xué)學(xué)科專業(yè)名稱：內(nèi)科學(xué)（血液?。┱撐拇疝q日期：2014年6月答辯委員會主席：評閱人：2014年5月摘要II摘要目的目的：觀察本實(shí)驗(yàn)室自制無血清培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增hESCs對其“干性”的維持以及Notch1的表達(dá)變化趨勢，以探討該培養(yǎng)體系長時(shí)間培養(yǎng)擴(kuò)增hESCs的效果以及Notch信號激活在維持hESCs“干性”中的作用。方法方法：收集自制無血清培養(yǎng)基傳代擴(kuò)增至第20代、30代的hESCs；應(yīng)用免疫熒光染色法檢測兩代hESCs特

3、異性標(biāo)志OCT4、Nanog、SSEA4的表達(dá)；堿性磷酸酶顯色法檢測兩代hESCs堿性磷酸酶活性；體外接種hESCs至免疫缺陷小鼠，觀察畸胎瘤形成，并行組織切片觀察內(nèi)、中、外三個(gè)胚層形成；應(yīng)用RealtimePCR、Westernbolt技術(shù)，比較Notch1信號分子在兩代細(xì)胞組分的表達(dá)情況，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果結(jié)果：（1）免疫熒光染色法結(jié)果：兩代hESCs細(xì)胞均表達(dá)OCT4、Nanog、SSEA4，呈強(qiáng)陽性反應(yīng)；（2）堿性磷酸酶顯色結(jié)果

4、示：顯微鏡下觀察兩代hESCs細(xì)胞均被染成藍(lán)紫色，呈強(qiáng)陽性反應(yīng)；（3）免疫缺陷小鼠畸胎瘤切片可見：分別注射了兩代hESCs的小鼠形成的畸胎瘤切片染色提示均有內(nèi)胚層、中胚層、外胚層組織的形成。（4）RealtimePCR技術(shù)比較Notch1基因在兩代細(xì)胞中的表達(dá)情況：hESCs的Notch1基因表達(dá)第30代是20代的（8.40.23）倍，p0.05。（5）Westernbolt技術(shù)比較Notch1蛋白在兩代細(xì)胞中的表達(dá)情況：第30代hES

5、Cs的Notch1蛋白300kd片段相對表達(dá)量為（0.170.013），第20代為（0.0160.002），第30代hESCs的Notch1蛋白120kd片段相對表達(dá)量為（0.410.021），第20代為（0.360.018），第30代hESCs的Notch1蛋白總表達(dá)水平明顯高于第20代hESCs（p0.05）。結(jié)論結(jié)論：（1）自制無血清無飼養(yǎng)層培養(yǎng)基能持續(xù)培養(yǎng)hESCs并維持其干性不變；（2）hESCs持續(xù)傳代后，Notch1信號分