NGR-L-PEI-ASON腫瘤靶向縮合體研究.pdf

1、反義寡聚核苷酸(ASON)可以與hTERT基因結(jié)合,有效地抑制端粒酶的表達(dá),從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或誘導(dǎo)其調(diào)亡,反義技術(shù)已經(jīng)成為一種重要腫瘤治療策略.用多聚陽(yáng)離子將ASON縮合成粒徑適宜、形態(tài)規(guī)則的超分子縮合體,是非病毒核酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)研究的一個(gè)重要分支.研究表明聚乙烯亞胺(PEI)具有很強(qiáng)的與ASON分子結(jié)合的能力,能與ASON分子形成穩(wěn)定的納米級(jí)縮合體.PEI/ASON縮合體表面可呈正電性,能夠非特異性的黏附于帶有負(fù)電荷的細(xì)胞表面,通過(guò)液

2、相內(nèi)吞的方式迅速進(jìn)入細(xì)胞,在體外轉(zhuǎn)染效率高.PEI/ASON縮合體易于制備和修飾,在ASON的體內(nèi)傳染方面表現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景. 本研究以單因素實(shí)驗(yàn)法考察了分支型聚乙烯亞胺/ASON(B-PEI/ASON)縮合體的制備工藝,研究了縮合體的物理化學(xué)性質(zhì).同時(shí)考察了親水性修飾物的抗凝聚作用和縮合體對(duì)ASON的保護(hù)作用.研究結(jié)果表明,N/P(PEI含有氮原子的摩爾數(shù)/ASON含有磷原子的摩爾數(shù))在3.5以上時(shí)ASON的包封率即可達(dá)到

3、100﹪;NaCl.影響縮合體的穩(wěn)定性,其濃度超過(guò)50 mmol/L,縮合體的粒徑即明顯增大;pH影響B(tài)-PEI中氨基的質(zhì)子化率,pH超過(guò)8.0后由于質(zhì)子化率變低,縮合體粒徑急劇上升;在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的范圍內(nèi),ASON的濃度對(duì)縮合體穩(wěn)定性沒(méi)有顯著的影響.制備B-PEI/ASON縮合體的優(yōu)化處方為:pH 7.0、N/P=4.O、C<,ASON>=100μg/ml,在此條件制備的縮合體平均粒徑120.6nm,平均zeta電勢(shì)33.84mv,形態(tài)規(guī)

4、整,無(wú)聚集粘連現(xiàn)象,ASON全部被荷載,能有效地對(duì)抗DNase Ⅰ對(duì)ASON的降解作用.NGR/L-PEI/ASON腫瘤靶向縮合體研究考察了N/P對(duì)線型聚乙烯亞亞胺/ASON(L-PEI/ASON)縮合體包封率的影響,以及右旋糖酐-70(Dextran-70)對(duì)L-PEI/ASON縮合體的保護(hù)作用.L-PEI/ASON縮合體的優(yōu)化處方為: pH 7.0、N/P=10.0、C<,ASPN>=100 ug/ml,此條件下制備的縮合體平均粒徑

5、156.7 nm,平均zeta電勢(shì)36.28 mv,ASON全部被荷載,能有效地對(duì)抗DNase I對(duì)ASON的降解作用.在L-PEI/ASON縮合體溶液中加入1﹪的Dextran-70能顯著地降低縮合體對(duì)"Cl"的敏感度. 為了制備具有腫瘤靶向特性的縮合體,本研究采用N/P=6.5的L-PEI/ASON縮合體作為靶向修飾的底物,以NGR多肽對(duì)其進(jìn)行靜電吸附修飾.制備NGR/L-PEJ:/ASON縮合體的優(yōu)化處方為:pH 7.0、

6、N/P<,PEI>=6.5、N/P<,NGR>=O.3、C<,ASON>=100μg/mL,此條件制備的縮合體平均粒徑128.1 nm,平均zeta電勢(shì)32.14 mv,縮合體呈不對(duì)稱的豌豆?fàn)?無(wú)聚集粘連現(xiàn)象,ASON全部被荷載,能有效地對(duì)抗DNasI對(duì)ASON的降解作用. 考察了NGR/L-PEI/ASON縮合體的體外促細(xì)胞吞噬作用、體內(nèi)(BAlB/C裸小鼠食管癌模型)腫瘤靶向特性和抗腫瘤活性.與游離的ASON實(shí)驗(yàn)組相比,NG

7、R/L-PEI/ASON縮合體組顯著地促進(jìn)了EC9706細(xì)胞的攝取作用,激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察可知,細(xì)胞核內(nèi)的熒光強(qiáng)度甚至超過(guò)了胞漿.經(jīng)皮下注射或尾緣靜脈注射,NGR修飾的縮合體均可以進(jìn)入到瘤體組織,且隨時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)入瘤體的藥物逐漸增多;未經(jīng)NGR修飾的縮合體靜脈給藥后不能被腫瘤組織攝取.靜脈給藥高劑量組和皮下給藥組小鼠瘤體在整個(gè)觀察期內(nèi)均生長(zhǎng)緩慢,最終測(cè)定瘤體的平均體積分別為183.6mm<'3>和172.5mm<'3>;而空白對(duì)

8、照組和正義對(duì)照組則分別為469.1mm<'3>和393.8 mm<'3>,有顯著性差異.瘤旁皮下注射組及靜脈注射實(shí)驗(yàn)組均可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡,透射電鏡下觀察可知,瘤體細(xì)胞胞漿凝集,染色質(zhì)邊集,核固縮、碎裂,有類圓形凋亡小體出現(xiàn),對(duì)照組腫瘤細(xì)胞未見(jiàn)典型凋亡小體. 本研究以L-PE工作為成核試劑,以NGR多肽作為表面電荷調(diào)節(jié)劑和靶向修飾劑,采用靜電吸附靶向修飾方法制備NGR-L-PEI/ASON縮合體,在體內(nèi)表現(xiàn)出了很好的靶向性和