NGR介導腫瘤血管靶向載基因納米粒的研究.pdf

1、本文以NGR(天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸,asparagines-glycine-arginine)肽為靶向因子,構建NGR肽修飾的靶向載基因自組裝納米粒。NGR肽可靶向腫瘤新生血管上皮細胞特異過量表達的CD13受體,因此,我們構建的這一新型載基因自組裝納米粒能夠主動靶向到腫瘤新生血管,實現靶向傳送目的基因,實現抗腫瘤血管生成基因治療的目的。
　　 除主動靶向功能外,理想的基因載體應具備高的基因裝載率,低毒,控制基因釋放等功能。以

2、聚乳酸-聚乙二醇PLA-PEG為載體材料,以增強型綠色熒光蛋白質?；?pEGFP)作為報告基因,以自主合成新型陽離子類脂十二烷酸6-(2,6-二氨基-己酰氧基)己酯(6-lauroxyhexyllysinate,LHLN)作為電荷調節(jié)劑,采用自組裝技術制備高裝載率荷基因納米粒,并在此基礎上,進行NGR肽修飾,以探索理想的非病毒基因載體的構建方法。實驗所選基因載體材料均生物相容；PEG可增加載體材料親水性和柔順性,提高DNA裝載率,同時

3、避免網狀內皮系統(tǒng)吞噬,延長體內循環(huán)時間；納米粒表面連接NGR肽,特異結合腫瘤新生血管上皮細胞過度表達的CD13受體,從而起到主動靶向和增強基因轉染效率的作用。通過研究NGR-CD13靶向結合及其介導的納米粒內在化過程,探索外源基因靶向進入細胞的機制；在基因靶向治療納米載體及其靶向機制研究上取得一定進展,為腫瘤的抗血管生成基因治療奠定實驗基礎及理論依據。課題主要研究方法與結果如下:
　　 1LHLN修飾陽離子PLA-PEG載基因納

4、米粒的研究在兩親性嵌段共聚物納米粒處方中引入陽離子類脂作為電荷調節(jié)劑來制備陽離子納米粒是促進非病毒基因載體基因轉染的主要手段。鑒于常用的單鏈陽離子類脂如CTAB和CPC具有較高的細胞毒性,本文利用本實驗室自行合成的新型單鏈陽離子類脂LHLN并用于載基因PLA-PEG納米粒的修飾,研究新型陽離子類脂LHLN修飾后促進基因轉染的效果。
　　 采用改良溶劑擴散法,以LHLN為電荷調節(jié)劑制備陽離子型PLA-PEG納米粒,與報告基因pEG

5、FP復合后得到載基因PLA-PEG納米粒(PLA-PEGNPs/pDNA),分別對其相關理化性質,細胞毒性,體外釋放特性,抗核酸酶降解的能力以及血漿穩(wěn)定性進行考察。通過體外基因轉染實驗對復合物在HeLa細胞,A549細胞,HepG2細胞中的轉染效率進行初步評價。所制備的新型空白PLA-PEG納米粒和PLA-PEGNPs/pDNA復合物均呈球形或類球形,平均粒徑分別為122.3±5.3nm和164.2±2.5nm；粒徑多分散指數分別為0.

6、223和0.288；Zeta電位分別為+24.0±6.8mV和+11.9±2.9mV。所制備的PLA-PEGNPs/pDNA結合緊密,具有較強的抗核酸酶能力。體外釋放藥物達20天,前期突釋過程很明顯,48h內累計釋放量達80.8％。24h至20d,釋藥過程非常緩慢,至20d時,累計釋放量達到94.6％,認為基本釋放完全。釋放行為符合雙向動力學方程:100-Q=90.22e-0.0735+22.04e-0.0034(ra=0.9822,r

7、b=0.9796)。體外細胞實驗表明,在轉染劑量下,與CTABPLA-PEGNPs/pDNA以及Lipofectamine相比,PLA-PEGNPs/pDNAs具有較低的細胞毒性(p<0.05)。轉染實驗結果表明,PLA-PEGNPs/pDNAs具有較高的轉染效率,在試驗的各種細胞中轉染效率均具有PLA-PEGNPs/pDNA>Lipofectamine>CTABPLA-PEGNPs/pDNA>裸DNA的趨勢。因此,LHLN是一種應用前

8、景廣泛,毒性小,體外轉染效率高的新型陽離子類脂,可用于促進納米粒的體外基因轉染效率。用其修飾的PLA-PEGNPs/pDNA,制備工藝簡單,毒性低,轉染效率高,具有一定開發(fā)前景。
　　 2NGR靶向陽離子型PLA-PEG納米粒的研究抗腫瘤血管生成基因治療是一種很有效的抗血管生成方法,采用基因轉導系統(tǒng)將治療基因運送到新生血管內皮細胞并使其高效表達,以自分泌和旁分泌的形式抑制腫瘤血管生成,可在腫瘤局部達到穩(wěn)定長效的作用。近年來研究表

9、明,含NGR序列的小肽可特異靶向腫瘤血管上皮細胞CD13受體,并且環(huán)狀NGR肽比線性NGR肽更具優(yōu)勢。
　　 本文設計和合成了具有血管內皮細胞靶向功能的環(huán)六肽CNGRCG(cNGR),并以其為靶向因子與載體材料PLA-PEG耦合(cNGR-PLA-PEG),制備cNGR修飾PLA-PEG納米粒(cNGR-PLA-PEGNPs)。靜電復合綠色熒光蛋白基因為報告基因制備載基因納米粒。分別對其相關理化性質,體外釋放特性,抗核酸酶降解的

10、能力以及血漿穩(wěn)定性進行考察。與普通PLA-PEG納米粒(PLA-PEGNPs)對比,通過體外細胞毒性試驗和基因轉染實驗對復合物在HUVEC細胞,A549細胞,HepG2細胞中的細胞毒性和轉染效率進行初步評價。
　　 結果,通過EDC/NHS法合成得到cNGR-PLA-PEG,核磁共振(1HNMR)和紅外(IR)驗證了其結構正確性。所制備cNGR-PLA-PEGNPs和cNGR-PLA-PEGNPs/pDNA復合物均呈球形或類球形

11、,平均粒徑分別為139.5±7.9nm和171.9±3.9nm；粒徑多分散指數分別0.290和0.167；Zeta電位分別為+22.14±1.88mV和+10.7±4.5mV。cNGR-PLA-PEGNPs表面cNGR修飾率達9.77±1.32％。所制備的cNGR-PLA-PEGNPs/pDNA結合緊密,具有較強的抗核酸酶能力和血漿穩(wěn)定性。體外釋放實驗結果表明,cNGR-PLA-PEGNPs/DNA釋放行為符合雙向動力學方程:100-Q

12、=83.93e-0.081t+18.47e-0.004t(ra=0.9899,rb=0.9874)。釋藥全過程包括快速釋放(0-12h)和緩慢釋放(24h-20d)兩個階段。前48h突釋明顯,累計釋放量達84.9％。24h至20d,釋藥過程非常緩慢,至20d時,累計釋放量達到98.2％,釋放完全。體外細胞實驗表明,在轉染劑量下,Lipofectamine相比,cNGR-PLA-PEGNPs/pDNA具有較低的細胞毒性(p<0.05)。轉

13、染實驗結果表明,在CD13表達陽性細胞中,cNGR-PLA-PEGNPs明顯高于在PLA-PEGNPs/pDNA,而在CD13表達陰性HepG2細胞中,cNGR-PLA-PEGNPs的轉染效率與PLA-PEGNPs/pDNAs沒有顯著差異(p>0.05)。因此,cNGR-PLA-PEGNPs具有較高的體外靶向性和轉染效率,有望成為一種高效的、能將治療基因靶向運輸到腫瘤新生血管部位的納米載體。
　　 3NGR介導靶向載基因PLA-

14、PEG納米粒入胞機制研究本文采用免疫熒光示蹤及流式細胞技術對受體介導基因載體的體外靶向性和與細胞相互作用機制進行了初步探討,以期在闡明機制的基礎上為基因載體構建指明方向。
　　 采用摻和熒光標記載體材料的方法分別制備熒光標記的cNGR-PLA-PEGNPs和PLA-PEGNPs并考察其理化性質。通過免疫熒光技術和流式細胞技術對CD13表達陽性細胞進行篩選。通過倒置熒光顯微鏡和流式細胞技術評價cNGR-PLA-PEGNPs和PLA

15、-PEGNPs的體外攝取特征和在不同細胞中入胞機制。結果表明,所制備的熒光標記cNGR-PLA-PEGNPs和PLA-PEGNPs均呈表面光滑圓整的球形,粒徑分別為149.6±8.4nm和136.9±4.5nm,多分散指數為0.247和0.183；納米粒的Zeta電位分別為+17.2±3.9和+19.54±2.3。熒光材料FITC-PLA-PEG的摻入不對納米粒的理化性質產生顯著影響。因此,可以用熒光標記納米粒來研究納米粒本身的特性與功

16、能。細胞表面CD13受體表達量的順序為:HUVEC>A549>HCT116>HepG2。選擇CD13陽性率最高的HUVEC細胞和CD13陰性HepG2細胞用于進一步的研究。納米粒體外攝取實驗結果表明,納米粒入胞為時間、濃度依賴性過程,并受低溫和代謝抑制劑的影響,cNGR-PLA-PEGNPs更容易進入HUVEC細胞。競爭抑制中,游離cNGR與cNGR-PLA-PEGNPs競爭細胞表面CD13受體,抑制細胞對其攝取,表明cNGR-PLA-

17、PEGNPs通過受體介導內吞途徑入胞。進一步的內吞抑制劑實驗表明,cNGR-PLA-PEGNPs進入HUVEC細胞為籠形蛋白和小窩蛋白介導相結合的機制,但以小窩蛋白介導為主,另外還涉及到少量程度的液相內吞。PLA-PEGNPs進入HUVEC細胞以巨胞飲途徑為主,伴有少量程度的籠形蛋白介導途徑。cNGR-PLA-PEGNPs進入HepG2細胞以小窩蛋白介導途徑為主,伴有少量程度的液相內吞。PLA-PEGNPs進入HepG2細胞主要涉及小窩

18、蛋白介導途徑和巨型胞飲途徑兩種機制,還有少量程度的液相內吞,但以巨型胞飲途徑為主。由此可見,納米粒類型和細胞類型均對納米粒的入胞途徑有著重要的影響。
　　 綜上所述,本文制備的NGR介導靶向載基因PLA-PEG納米粒對DNA保護作用強,所載DNA能夠從載體中緩慢釋放,細胞耐受性良好,具有較高的體外靶向性和轉染效率,其入胞機制涉及籠形蛋白介導和小窩蛋白介導兩種途徑。在此基礎上進一步研究影響基因載體細胞內命運的關鍵因素,從而對其載體