血管靶向性載VEGF165基因納米粒子在治療肢體缺血的實驗研究.pdf

1、背景和目的: 近年來，外周動脈疾病的發(fā)病率逐年升高，尤其是下肢缺血性疾病已經(jīng)成為危害人類健康的嚴重疾病。目前針對下肢缺血性疾病主要手段是藥物、外科手術(shù)、腔內(nèi)治療等。但是對于遠端流出道嚴重狹窄尤其是合并糖尿病的患者往往沒有手術(shù)機會，目前還缺乏令人滿意的治療方法。應(yīng)用各種方法和手段促進新生血管生成，促進缺血肢體側(cè)枝循環(huán)的建立，是有效可行的研究方向之一。 基因治療是目前研究較多的治療缺血性疾病的一項新技術(shù)。血管內(nèi)皮生長因子(V

2、EGF)在治療缺血性疾病中的作用已經(jīng)得到肯定，它能增加小血管的通透性、促進內(nèi)皮細胞增殖和遷移，抑制內(nèi)皮細胞凋亡，并能刺激內(nèi)皮細胞產(chǎn)生纖溶酶原激活物，從而有力地促進血管新生。但是，目前對于VEGF基因治療仍存在著許多局限性：(1)外源性VEGF雖能促進血管生成，但其靶向治療能力差，因此要達到治療下肢缺血目的所需的劑量較大，而增大劑量勢必增加其副作用，甚至還有增加促腫瘤生成和加重糖尿病性視網(wǎng)膜病變的潛在風險。(2)病毒性基因載體轉(zhuǎn)染效率高，

3、但其促腫瘤生成、細胞毒性和免疫原性等安全性問題需要重視。后來發(fā)展的非病毒性載體，如陽離子聚合物，毒性小，安全性較高。其中殼聚糖作為一種天然陽離子聚合物的非病毒基因載體，顯示了較好的前景。它具有細胞毒性低、生物相容性好、基因免疫性低等優(yōu)點。其納米粒子形式包載DNA，載藥量較大，可以保護DNA在體內(nèi)不被酶降解，還能起到緩慢釋放DNA的效果。但其細胞轉(zhuǎn)染效率較低，生物靶向性較差，因而也限制了它在基因治療方向的應(yīng)用。 因此，如何優(yōu)化基因

4、載體和增強局部治療的靶向性是目前基因治療需要解決的主要問題。 RGD肽是一類含有精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(Arg—Gly—Asp)的短肽，其作用是通過和整合素的特異性結(jié)合來實現(xiàn)的。整合素αvβ3是含有數(shù)個RGD位點的細胞受體，在血管生成過程中起到重要的作用。在成熟血管內(nèi)皮細胞表面αvβ3整合素呈低水平表達，但在缺血狀態(tài)下的新生血管內(nèi)皮細胞中αvβ3的表達顯著上升。利用外源性RGD對整合素αvβ3的靶向結(jié)合特性，可以攜帶促進新生血

5、管生成的藥物或基因進入體內(nèi)缺血局部起治療作用，從而治療肢體缺血等疾病。 為提高殼聚糖納米粒子非病毒基因載體的轉(zhuǎn)染效率和生物靶向性，并將其應(yīng)用于治療缺血性疾病，本研究通過以共價鍵將RGD多肽結(jié)合在殼聚糖上，制備成納米粒子基因載體，并包載VEGF165質(zhì)粒，分別通過體外細胞實驗和動物實驗觀察其靶向特異性和生物學效應(yīng)，從而為基因靶向治療缺血性疾病的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 內(nèi)容和方法: 1.RGD肽表面修飾殼聚糖載基因納

6、米粒子(CH—RGD)及FITC標記納米粒子(FITC—CH—RGD)的制備，X射線光電子譜(XPS)進行材料定性，透射電鏡測量納米粒子的粒徑，凝膠電泳阻滯實驗確定最大質(zhì)粒包封率的N/P值。 2.體外Hy926內(nèi)皮細胞實驗： (1)利用激光共聚焦顯微鏡和流式細胞技術(shù)觀察內(nèi)皮細胞對FITC—CH—RGD和FITC—CH納米粒子的結(jié)合和吞噬情況比較； (2)包載pEGFP—C1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hy926細胞，分為3組：CH—

7、RGD-PEGFP組、CH-PEGFP組和Lipofetamine2000-pEGFP組，轉(zhuǎn)染后48h熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率； (3)包載pIRES2—VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hy926細胞，分為3組：CH—RGD-PVEGF165組、CH-PVEGF165組和Lipofetamine2000-pVEGF165組，分別于轉(zhuǎn)染后第1，3，7，14天取上清用ELISA法測定VEGF蛋白表達； (4)倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后各組細

8、胞檢測日期的形態(tài)及存活情況。 3.動物實驗： (1)建立小鼠股動脈結(jié)扎切斷后肢缺血模型，根據(jù)實驗需求分為CH—RGD-PVEGF165治療組、CH-PVEGF165治療組、pVEGF質(zhì)粒治療組和空白對照組。給藥方式為患肢肌肉注射，于結(jié)扎股動脈后7天后給藥。 (2)分別于給藥后3天、7天、14天取材缺血側(cè)腓腸肌組織和對側(cè)腓腸肌組織；行HE染色、免疫組化染色(PCNA、VEGF)評價肌肉組織間的新生毛細血管生成、VE

9、GF表達情況；Real Time-PCR檢測VEGF mRNA含量及Western Blot檢測VEGF表達含量。 結(jié)果: 1.以共價鍵將RGD多肽結(jié)合在殼聚糖上，制成納米粒子形式，X射線光電子譜證實產(chǎn)物為CH—RGD；透射電鏡測得粒徑范圍為30～50nm；包載質(zhì)粒DNA后，凝膠電泳阻滯實驗顯示最大質(zhì)粒包封率時N/P值為2：1。 2.體外細胞實驗： 將制得的FITC熒光標記RGD肽表面修飾的殼聚糖納米粒子

10、加入體外培養(yǎng)的Hy929細胞，通過流式細胞技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡觀察證實其在體外對內(nèi)皮細胞具有很強的靶向結(jié)合特性，而且能促進內(nèi)皮細胞的內(nèi)吞作用。 包載EGFP質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染Hy926細胞實驗中，CH—RGD-PEGFP組較CH-PVEGF165組轉(zhuǎn)染效率明顯提高(35.7％vs14.3％，p<0.001)，較Lipofetamine2000-pEGFP組稍增高(35.7％vs31.3％，p>0.05)； 包載VEGF165

11、質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染Hy926細胞實驗中，CH—RGD—VEGF165轉(zhuǎn)染組細胞上清液中VEGF濃度在轉(zhuǎn)染后1、3、7、14天均較其他兩組明顯增高。(除第1天CH—RGD—VEGF165轉(zhuǎn)染組與Lipo-PVEGF165組比較p>0.05外，其余p值均<0.01。) CH—RGD-PVEGF165組及CH-PVEGF165組于轉(zhuǎn)染后1、3、7、14天存活細胞總數(shù)均較Lipo-PVEGF165組有顯著性差異(p值均<0.01)，而CH—R

12、GD-PVEGF165組和CH-PVEGF165組之間無明顯差異。表明CH—RGD在體外對內(nèi)皮細胞無明顯細胞毒性。 3.動物實驗： 在后肢缺血模型小鼠中，HE染色和PCNA免疫組化染色顯示CH—RGD-PVEGF165治療組較其余各組缺血肢體中新生毛細血管生成明顯增多，而組織缺血表現(xiàn)較輕；每張HE染色切片在×100倍隨機5個視野計數(shù)毛細血管的數(shù)目也明顯增多(p值均<0.01)；VEGF免疫組化顯示毛細血管內(nèi)皮和周圍組織中

13、VEGF表達顯著增高； Real-Time結(jié)果顯示，CH—RGD-PVEGF165治療組較其余各組和健側(cè)肌肉中VEGFmRNA的表達量明顯增高。(p值均<0.01) Western Blot結(jié)果顯示：CH—RGD-PVEGF165治療組較其余各組和健側(cè)肌肉中VEGF的表達顯著增高。(p值均<0.01) 治療后到14天觀察，CH—RGD-PVEGF165治療組和CH-PVEGF165治療組未見患肢壞死、感染，組織水

14、腫不明顯。而pVEGF165治療組及空白對照組見足趾局灶性壞死，其中C組2只，占總數(shù)的33％；D組3只，占D組總數(shù)的50％。 結(jié)論: 1.RGD肽表面修飾的CH納米粒子在體外對內(nèi)皮細胞具有很強的靶向結(jié)合特性，而且能促進內(nèi)皮細胞的內(nèi)吞作用。 2.RGD肽表面修飾的CH納米粒子作為基因載體，其體外對內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)染效率比殼聚糖納米粒子明顯提高，較Lipofetamine2000稍增高；包載VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞