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文檔簡介
1、目的:
本研究通過血管內(nèi)皮生長因子165(Vascular endothelial growth factor165,VEGF165)刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),檢測MAPK信號通路中ERK、p38、JNK的磷酸化水平及尿激酶型纖溶酶原激活物(Urokinase-type plasminogen activator,uPA)蛋白表達變化,來
2、研究外源性VEGF165促進HUVECs細胞uPA蛋白表達的過程中MAPK信號通路的作用。
方法:
1.驗證VEGF165對HUVECs細胞增殖的影響:采用不同濃度的VEGF165(0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、30 ng/mL和50 ng/mL)培養(yǎng)HUVECs細胞,CCK-8(水溶性四唑鹽比色法)檢測細胞增殖情況。
2.驗證VEGF165對uPA蛋白表達的影響:分別以10 ng/ml
3、的VEGF165培養(yǎng)液和不含VEGF165的培養(yǎng)液培養(yǎng)HUVECs細胞,24 h,48 h,72 h后采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot,WB)法檢測各組uPA蛋白的表達。
3.驗證VEGF165對MAPK信號通路的影響:分別以10 ng/ml的VEGF165培養(yǎng)基和不含VEGF165的培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs細胞,0 h、6 h、12 h及24 h后WB檢測各組ERK、p38、JNK磷酸化水平。
4.確定與u
4、PA蛋白表達相關的MAPK信號通路:為確認ERK信號通路在VEGF165上調(diào)uPA蛋白表達過程中的作用,我們應用該通路的特異性阻斷劑PD98059干預信號傳導,實驗分組如下:control組,VEGF165處理組,PD98059預處理1 h組,PD98059預處理1 h+VEGF165組。WB檢測uPA蛋白表達及p-ERK水平;為證實p38信號通路在VEGF165上調(diào)uPA蛋白表達過程中的作用,應用該通路的特異性阻斷劑SB203580干
5、預信號傳導,實驗分組同上,WB檢測uPA蛋白表達及p-p38水平;為確認JNK信號通路在VEGF165上調(diào)uPA蛋白表達過程中的作用,我們應用該通路的特異性阻斷劑SP600125干預信號傳導,實驗分組同上,WB檢測uPA蛋白表達及p-JNK水平。
5.驗證 MAPK三條通路的交互關系:分別以50 uM PD98059、20 uMSB203580和10 uM SP600125作用于HUVECs細胞,并采用WB方法檢測各組ERK、
6、p38和JNK磷酸化水平。
結(jié)果:
1.隨VEGF165濃度增高,HUVECs細胞的光密度值(Optical Density,OD)都增高,與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),VEGF165濃度為10 ng/mL時OD值達到最高,繼續(xù)升高VEGF165濃度,OD值無明顯改變(P>0.05)。
2.VEGF165刺激HUVECs細胞后,24 h、48 h、72 h uPA/GAPDH的相對強度值持
7、續(xù)升高,差異均有統(tǒng)計學差異(P<0.05);對照組各時間點uPA/GAPDH值無差異(P>0.05);VEGF165組與對照組uPA/GAPDH比較,24 h無差異(P>0.05),48 h和72 h差異明顯(P<0.05)。
3.VEGF165培養(yǎng)HUVECs細胞后0 h、6 h、12 h和24 h檢測,結(jié)果p-ERK水平不斷增高,除0 h與6 h比較無差異,其余各時間點間差異明顯(p<0.05),p-p38和p-JNK水平
8、也不斷增高,各時間點間差異明顯(p<0.05);而ERK、p38和JNK總蛋白水平組間無差異(p>0.05)。對照組p-ERK、p-p38和p-JNK水平各時間點無明顯變化(p>0.05)。
4.分別以PD98059、SB203580和SP600125預處理1 h后用VEGF165培養(yǎng)HUVECs細胞,與對照組比較,只有SB203580能抑制uPA蛋白表達(p<0.05)。
5.PD98059、SB203580和SP
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