乳腺癌中TRAF4通過調(diào)節(jié)Girdin的表達(dá)和核定位參與AKT信號(hào)通路.pdf

1、前言:
　　腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAF）家族成員在許多類型腫瘤中有著過表達(dá)，并且參與了多種信號(hào)通路。TRAF4通過Smurf-1介導(dǎo)的泛素化來增加細(xì)胞的遷移，激活TGF受體信號(hào)通路從而促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移。此外，在肺癌中TRAF4是激活A(yù)KT信號(hào)通路的關(guān)鍵分子。雖然TRAF4在許多腫瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有著過表達(dá)，但其具體機(jī)制仍未闡明。
　　TRAF4調(diào)節(jié)許多與癌癥相關(guān)的基因從而參與各種生物學(xué)過程，如遷移，侵襲，轉(zhuǎn)移和血管化，而

2、Girdin都明顯的參與以上各種過程。因此，Girdin很有可能也是TRAF家族影響的候選基因。有文獻(xiàn)報(bào)道，TRAF4與Girdin都參與PI3-K/Akt信號(hào)通路，而該通路與腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系。有人發(fā)現(xiàn)，TRAF4在肺癌中通過泛素化的作用來激活A(yù)KT信號(hào)通路。
　　綜上，我們提出TRAF4可能與Girdin在腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮協(xié)同作用。為了驗(yàn)證該假說，我們分析了TRAF4與Girdin在乳腺癌中的表達(dá)與定位情況，以及二者

3、互作的情況。這些結(jié)果將為乳腺癌的防治提供新的思路和指導(dǎo)意義。
　　方法:
　　1、免疫組化
　　分析38例乳腺癌組織中TRAF4與Girdin的表達(dá)相關(guān)性。
　　2、細(xì)胞培養(yǎng)
　　正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A，低轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系MCF-7以及高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231。
　　3、免疫共沉淀
　　檢測(cè)TRAF4與Girdin的結(jié)合狀況。
　　4、免疫熒光染色
　　檢

4、測(cè)TRAF4與Girdin的核漿定位及其共定位。
　　5、轉(zhuǎn)染
　　按照Attractene轉(zhuǎn)染試劑或HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑盒細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
　　6、Western blot
　　應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染TRAF4前后，Girdin的變化:檢測(cè)干擾TRAF4前后Girdin的總量變化和核漿的變化。
　　7、Transwell
　　分析細(xì)胞的侵襲能力。
　　8、統(tǒng)計(jì)分析

5、r>　　采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05為差異具有顯著性。
　　結(jié)果:
　　1、TRAF4與Girdin在乳腺癌中表達(dá)呈正相關(guān)
　　免疫組化分析結(jié)果顯示，TRAF4與Girdin在乳腺癌組織中表達(dá)。TRAF4在乳腺組織中呈細(xì)胞核和細(xì)胞漿表達(dá)，Girdin呈細(xì)胞漿和細(xì)胞核表達(dá)。在乳腺癌中TRAF4的表達(dá)與Girdin表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.05)。
　　2、在乳腺癌

6、中TRAF4與Girdin相互作用
　　免疫共沉淀分析發(fā)現(xiàn)，TRAF4與Girdin在乳腺癌細(xì)胞中相結(jié)合。免疫熒光分析說明TRAF4與Girdin在乳腺癌細(xì)胞中存在共定位，并驗(yàn)證了TRAF4和Girdin乳腺癌細(xì)胞中的定位。
　　3、在乳腺癌中TRAF4促進(jìn)Girdin蛋白的表達(dá)
　　在MDA-MB-231細(xì)胞中上調(diào)TRAF4后，Girdin的表達(dá)量增加，AKT表達(dá)增高。在MDA-MB-231細(xì)胞中干擾TRAF4后，G

7、irdin的表達(dá)量降低，AKT表達(dá)減弱。
　　4、在乳腺癌中TRAF4促進(jìn)Girdin蛋白的核定位
　　免疫熒光分析MDA-MB-231細(xì)胞中上調(diào)TRAF4和下調(diào)TRAF4后，Girdin的細(xì)胞定位。結(jié)果表明TRAF4表達(dá)上調(diào)后，Girdin細(xì)胞核定位增加。Western blot分別分析MDA-MB-231細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)的Girdin表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上調(diào)TRAF4后細(xì)胞核內(nèi)Girdin表達(dá)增加。
　　5、在乳腺癌細(xì)

8、胞中TRAF4通過調(diào)節(jié)Girdin蛋白參與AKT信號(hào)通路
　　我們用Westeron印跡法檢測(cè)了LY294002與TRAF4處理后的不同MDA-MB-231細(xì)胞系P-AKT和AKT的蛋白水平。結(jié)果顯示，在MDA-MB-231細(xì)胞系中加入LY294002，P-AKT和AKT的蛋白水平下降。而在加入LY294002的轉(zhuǎn)染TRAF4后的MDA-MB-231細(xì)胞系中，由于TRAF4所增加的P-AKT和AKT蛋白的表達(dá)量有所降低。這些結(jié)果表

9、明，TRAF4對(duì)Girdin的影響是通過AKT信號(hào)通路的。
　　6、TRAF4通過調(diào)節(jié)Girdin蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞侵襲
　　TRAF4可以促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲，但是當(dāng)上調(diào)TRAF4表達(dá)的同時(shí)下調(diào)Girdin蛋白表達(dá)以后，TRAF4促進(jìn)細(xì)胞侵襲能力減弱。說明TRAF4通過Girdin促進(jìn)細(xì)胞的侵襲。
　　結(jié)論:
　　TRAF4與Girdin在乳腺癌中相互作用，其在乳腺癌組織中表達(dá)呈正相關(guān)，TRAF4