腺病毒介導(dǎo)VEGF165基因預(yù)防移植靜脈再狹窄的研究.pdf

1、目的:攜帶免疫熒光的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor165, VEGF165)基因的復(fù)制缺陷性腺病毒( Adenovirus serotype5,Ad5)即 Ad5-VEGF165-CMV-EGFP在體外通過孵育的方法轉(zhuǎn)染靜脈橋然后再行血管旁路移植術(shù),研究 VEGF165基因所表達(dá)的蛋白對(duì)自體移植靜脈內(nèi)膜的影響。
　　方法:購買來的 Ad5-VEGF165-CMV-EGFP

2、在人胚腎293細(xì)胞上擴(kuò)增到需要病毒數(shù)后經(jīng)過氯化銫(caesium chloride, CSCL)梯度離心法純化。經(jīng)過PCR鑒定腺病毒確實(shí)含有目的基因后冷凍備存。在自制血管支撐器輔助下行兔左側(cè)股動(dòng)脈搭橋手術(shù),橋血管采用股靜脈。實(shí)驗(yàn)組股靜脈浸泡于含VEGF165腺病毒的溶液中(病毒滴度為1.0×109pfu/ml),對(duì)照組浸泡于鹽水中,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組都需37℃孵育30分鐘,溫鹽水沖洗備用。依次在術(shù)后2d、4d、6d、8d、10d、12d、1

3、4d、3w、4w、5w、6w、7w從實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中各處死一只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,對(duì)橋血管VEGF165基因行RT-PCR檢測(cè)。用測(cè)微尺測(cè)量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的股靜脈的內(nèi)膜的厚度,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)算靜脈內(nèi)膜的增生指數(shù),繪出股動(dòng)脈搭橋術(shù)后時(shí)間—移植靜脈內(nèi)膜增生曲線。還對(duì)移植靜脈進(jìn)行HE和彈力纖維染色直接觀察內(nèi)膜增生的組織學(xué)變化。
　　結(jié)果: Ad5-VEGF165-CMV-EGFP能夠在293細(xì)胞很好的擴(kuò)增,轉(zhuǎn)染11天就可以收毒。經(jīng)過三代擴(kuò)增、

4、純化就能得到腺病毒顆粒數(shù)2.5×1011 VP/ml,滴度為1×1010 PFU/ml。在股動(dòng)脈搭橋手術(shù)中用自制的血管支撐器會(huì)帶來很多便利,如對(duì)初學(xué)者來說提高吻合成功率、縮短手術(shù)時(shí)間約10分鐘。靜脈橋mRNA檢測(cè)得出術(shù)后兩天就有表達(dá),一直可以持續(xù)的6周。HE染色和彈力纖維染色提示轉(zhuǎn)基因組移植靜脈的內(nèi)膜增生較對(duì)照組小,但也增生。兩者結(jié)果經(jīng)過Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)得出具有顯著性差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。內(nèi)膜增生指數(shù)也顯示對(duì)照組比轉(zhuǎn)基因組增生嚴(yán)