三株含有人FGF-2、VEGF165、VEGF121基因非復(fù)制型腺病毒的構(gòu)建和鑒定.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的構(gòu)建三株含有hFGF2、hVEGF165、hVEGF121基因的非復(fù)制型重組腺病毒,以期用于皮瓣血運(yùn)障礙的基因治療.方法以AdEasy系統(tǒng)為基礎(chǔ),利用原核細(xì)胞的同源重組機(jī)制構(gòu)建非復(fù)制型重組腺病毒.首先設(shè)計(jì)引物,通過RT-PCR從Hep-2細(xì)胞(喉鱗癌細(xì)胞)的總mRNA中擴(kuò)增得到三個(gè)目的基因的cDNA.分別將其重組到克隆載體pGEM-T Easy中,經(jīng)測序證實(shí)后,進(jìn)一步重組到穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV上,獲得分別含有三種不同目的

2、基因的重組穿梭質(zhì)粒.用Pme I酶切線性化重組穿梭質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)化含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的E.coli BJ5183/p的感受態(tài)細(xì)胞,完成同源重組.取陽性克隆、小提質(zhì)粒.再分別轉(zhuǎn)化E.coliDH10B感受態(tài)細(xì)胞,獲得可產(chǎn)生高拷貝質(zhì)粒的E.coli DH10B菌株.采用限制性內(nèi)切酶分析、測序等方法對三種重組腺病毒質(zhì)粒進(jìn)行鑒定.最后將重組腺病毒質(zhì)粒用Pac I酶切,獲得重組腺病毒DNA分子,用脂質(zhì)體法,轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞,得到三

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