腫瘤細胞靶向轉錄載體的研究.pdf

1、基因治療的一個主要問題是對治療基因表達的空間和時間的控制。一些腫瘤治療方案中，轉移基因在腫瘤外組織和細胞中的表達導致正常組織的破壞和難以預料的毒性。因此，如果能以精確地調控或特異性地靶向表達的方式控制治療基因的表達，則可極大地提高基因治療的安全性和有效性。人端粒酶活性與腫瘤細胞之間有良好的相關性，85％以上的惡性腫瘤端粒酶活性被重新激活，而絕大多數成年體細胞的端粒酶活性為陰性。實驗證明，端粒酶催化亞基(humantelomerasere

2、versetranscriptase，hTERT)的激活表達是端粒酶活性重新激活的限速步驟。根據hTERT在腫瘤細胞中的重新激活而在正常體細胞中沉默的特點，提示可應用催化亞基的調控表達序列，構建腫瘤細胞靶向轉錄載體，為腫瘤的生物治療提供一種新的特異性表達系統(tǒng)。本研究應用hTERT的啟動子序列構建腫瘤細胞靶向轉錄逆轉錄病毒載體。以端粒酶催化亞基起始轉錄區(qū)的上游-1到-2069段的啟動子序列分別構建調控報道基因EGFP、P53和TK的逆轉錄

3、病毒載體pRH2kbEGFP、pRH2kbP53、pRH2kbTK。以脂質體為介導分別將這些載體質粒轉染端粒酶活性陽性的腫瘤細胞株，如Hela、HepG2、T24、B16、HT29、A594、ECV304、CCC等，端粒酶活性陽性的永生細胞株，如293細胞，及端粒酶活性陰性的正常體細胞株，如WI38細胞、2BS細胞等。在轉染48小時后，熒光顯微鏡鏡檢，在端粒酶活性為陽性的轉染細胞(如腫瘤細胞，永生化細胞)中，檢測到發(fā)綠色熒光的細胞，而在

4、端粒酶活性為陰性的轉染細胞中沒有檢測到發(fā)綠色熒光的細胞。說明人端粒酶催化亞基啟動子可在腫瘤細胞中靶向性轉錄報道基因。而用流式細胞儀檢測轉染了pRH2kbP53的細胞，結果表明轉染的肝癌細胞HepG2的凋亡率為19％±2％，轉染的ECV304細胞為19％±2％，轉染的T24細胞為14％±3％，轉染的HT29細胞為17％±3％，轉染的2BS細胞的凋亡率僅為0.40％±1％；而以pCMV啟動子調控表達的p53基因，轉染HepG2后的凋亡率達2

5、8％±3％。說明人端粒酶催化亞基啟動子的強度比pCMV啟動子弱，但調控表達治療基因的量足以引起轉染細胞的生物學效應。將pRH2kbTK載體質粒轉染HrpG2，在潮霉素B(400μg/ml)的壓力下選擇10天，得穩(wěn)定克隆，在30μM的GCV存在下，7天的時間，穩(wěn)定克隆全部死亡。取20％穩(wěn)定轉染的HepG2克隆細胞，80％的未轉染細胞，混合培養(yǎng)，而在30μM的GCV存在下5天，60％的細胞死亡，而未加轉染的細胞則正常生長，從而顯示出旁觀者效