可控性球形多孔β-TCP支架內(nèi)部血管化規(guī)律的研究.pdf

1、迅速而有效的血運(yùn)重建是構(gòu)建大塊組織工程骨的先決條件。支架內(nèi)新生的血管有以下作用：
　?、贋橹Ъ懿牧仙畈康募?xì)胞提供存活所必需的養(yǎng)分和氧氣；
　　②血供系統(tǒng)可向支架內(nèi)部輸送生長(zhǎng)因子、鈣離子等，刺激未分化的間充質(zhì)細(xì)胞形成成骨細(xì)胞，間接影響新骨生成；
　?、塾醒芯繄?bào)道血流量可調(diào)控礦物質(zhì)沉積。因缺乏血液供應(yīng)，目前組織工程骨均較小，無(wú)法滿足臨床需要。因此，研究支架材料的血管化規(guī)律具有重要意義。
　　目前，組織工程骨血管化的研

2、究側(cè)重兩個(gè)方面：一是對(duì)支架材料施加外來(lái)影響因素，如復(fù)合血管內(nèi)皮細(xì)胞、生長(zhǎng)因子或顯微外科血運(yùn)重建；二是從支架材料本身著手，尋找適宜血管生長(zhǎng)的最優(yōu)結(jié)構(gòu)。然而，支架內(nèi)部血管生長(zhǎng)的規(guī)律還知之甚少，尤其缺乏具體的量化數(shù)據(jù)。同時(shí)，以往研究的支架材料大多為圓片狀、長(zhǎng)方體或顆粒狀等，外形及內(nèi)部結(jié)構(gòu)不規(guī)則，孔隙大小不均一，內(nèi)連接孔較小，不同方向上組織的長(zhǎng)入存在差異性，而且不同的觀察切面其結(jié)果也存在差異，最終的結(jié)論并不一致。本課題的目的是研究三維孔隙結(jié)構(gòu)影

3、響下的機(jī)體組織血管生長(zhǎng)的規(guī)律，得出具體的血管生長(zhǎng)的量化參數(shù)，如血管形成的速度、數(shù)量、直徑、面積等參數(shù)，有助于將前述的兩種促進(jìn)人工骨血管化的方法有機(jī)結(jié)合，如改進(jìn)支架結(jié)構(gòu)，優(yōu)選在支架上接種種子細(xì)胞的數(shù)量和時(shí)機(jī)。獲得支架內(nèi)部血管化的量化數(shù)據(jù)是本研究的創(chuàng)新點(diǎn)之一。實(shí)驗(yàn)材料為可控性球形多孔β-TCP支架，因球體規(guī)則，無(wú)各向異性，組織長(zhǎng)入和觀察研究不受方向的影響；材料內(nèi)部微結(jié)構(gòu)完全可控，具有均一的球形孔隙，孔壁光滑，孔隙連通率＞99％，大孔和內(nèi)連接

4、孔直徑控制在前期比較研究得出的最佳范圍。該球形支架的設(shè)計(jì)和參數(shù)是其他研究所沒(méi)有的，具有創(chuàng)新性。實(shí)驗(yàn)方法上，通過(guò)不脫鈣硬組織切片下圖像采集，基于分?jǐn)?shù)幾何體概念將三維參數(shù)用二維數(shù)據(jù)表現(xiàn)，減小了組織形態(tài)測(cè)定中可能出現(xiàn)的誤差，是本研究的另一創(chuàng)新點(diǎn)。
　　本課題由兩部分組成。
　　第一部分，定性研究球形多孔β-TCP支架植入體內(nèi)后，機(jī)體組織對(duì)其的生物學(xué)響應(yīng)，以了解此材料是否適于血管化的研究。
　　方法：術(shù)后1、2、4、8、12周

5、取材，進(jìn)行脫鈣組織切片HE染色、麗春紅三色染色，硬組織切片Van Gieson’s苦味酸-品紅染色，掃描電鏡檢查。
　　結(jié)果：術(shù)后1周細(xì)胞遷入；2周出現(xiàn)膠原纖維和幼稚的血管芽；4周時(shí)血管、膠原纖維數(shù)量增多；8周時(shí)大孔周邊出現(xiàn)新月形新生骨和類骨質(zhì)；12周時(shí)材料明顯降解，組織內(nèi)見(jiàn)成熟的血管及骨組織。
　　小結(jié)：所用球形多孔β-TCP支架具有良好的生物學(xué)性能，適于血管化的研究。其內(nèi)成骨過(guò)程為膜內(nèi)成骨，血管直徑受內(nèi)連接孔限制。

6、>　　第二部分，量化分析球形多孔β-TCP支架內(nèi)部的血管化過(guò)程。采用與第一次實(shí)驗(yàn)相同的實(shí)驗(yàn)材料植入兔腰背肌肉筋膜袋中，術(shù)后1、2、4、8、12周取材，過(guò)球體中心做硬組織切片，Van Gieson’s染色，16倍鏡下在隨機(jī)設(shè)定的x、y軸取4個(gè)區(qū)域，50倍鏡下在上述四個(gè)區(qū)域中隨機(jī)取4個(gè)視野，用Leica MTLA全自動(dòng)專業(yè)研究級(jí)顯微鏡(德國(guó)Leica公司)進(jìn)行圖像采集，得到16張圖片。每個(gè)圖像中測(cè)量血管數(shù)、血管直徑、組織長(zhǎng)入深度比例、血管面

7、積相對(duì)百分比等參數(shù)，并將16個(gè)視野的數(shù)據(jù)求均值得到每張切片的相應(yīng)參數(shù)值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：術(shù)后2w出現(xiàn)幼稚的血管芽，4w時(shí)為血管化的第一個(gè)高峰，與2w比血管數(shù)量增加（P＜0.05），8w時(shí)血管數(shù)及直徑增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），12w時(shí)為第二次血管化高峰，見(jiàn)粗大成熟的血管，與其他時(shí)間比血管直徑增大（P＜0.05），管壁增厚，有分支血管出現(xiàn)，但是血管數(shù)量變化不大（P＞0.05）。
　　小結(jié)：此種特定支架內(nèi)部

8、血管生長(zhǎng)呈現(xiàn)“雙峰型”模式，即血管化分兩階段進(jìn)行，4w內(nèi)以細(xì)小的幼稚血管快速增加為主，血管直徑保持在50～70μm；12w時(shí)血管數(shù)量變化不明顯，但血管直徑增大顯著，甚至＞200μm，塑形改造為成熟血管。“雙峰型”血管化模式的意義在于構(gòu)造組織工程骨的早期，應(yīng)復(fù)合大量的血管內(nèi)皮細(xì)胞或前體細(xì)胞，并能持續(xù)成活至4w，以生成大量的血管芽；至12w，支架材料應(yīng)能適度降解，使孔徑和內(nèi)連接徑增大以適應(yīng)血管增粗的需要。
　　結(jié)論：本課題研究所用的可