SD大鼠視桿雙極細(xì)胞L-鈣通道電流特點(diǎn).pdf

1、雙極細(xì)胞是脊椎動(dòng)物視網(wǎng)膜的谷氨酸中間神經(jīng)元，它接受光感受器細(xì)胞的信號(hào)輸入，在整合后傳遞至無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。而在視網(wǎng)膜的信號(hào)傳遞中，雙極細(xì)胞的突觸前終末還受到無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的負(fù)反饋抑制，影響其對(duì)下一級(jí)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的遞質(zhì)分泌，因此雙極細(xì)胞在視網(wǎng)膜信號(hào)傳遞的過(guò)程處于一個(gè)關(guān)鍵的位置。雙極細(xì)胞通過(guò)其形態(tài)和生理方面的特征被分為視桿雙極細(xì)胞和視錐雙極細(xì)胞，其中大鼠視桿雙極細(xì)胞在形態(tài)上特征明顯，易于辨認(rèn)，而視錐雙極細(xì)胞則形態(tài)多樣，目前根據(jù)形態(tài)學(xué)分為9種

2、類(lèi)型。由于Ca2+流入細(xì)胞對(duì)于神經(jīng)遞質(zhì)出胞有重要作用，很多學(xué)者致力于神經(jīng)元上Ca2+通道的特點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)大鼠視網(wǎng)膜視桿雙極細(xì)胞釋放的神經(jīng)遞質(zhì)的基礎(chǔ)是L型Ca2+通道介導(dǎo)的Ca2+電流，因此L-Ca2+通道的功能失調(diào)則會(huì)影響視桿雙極細(xì)胞的神經(jīng)傳導(dǎo)。
　　我實(shí)驗(yàn)室在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)兩種自發(fā)性突變大鼠，分別為先天性靜止性夜盲（congenitalstationarynightblindnessCSNB）和視網(wǎng)膜錐體細(xì)胞失功能（retinalc

3、onedegenerationRCD）。目前已知前者的致病基因?yàn)閏acna1f，該基因?yàn)橐环NL型鈣通道基因，該通道蛋白位于視桿細(xì)胞突觸后膜上，調(diào)節(jié)視桿細(xì)胞。通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度而影響視桿細(xì)胞突觸遞質(zhì)的釋放。探索相關(guān)的研究方法，了解正常大鼠L型Ca2+通道的性質(zhì),對(duì)于研究我們實(shí)驗(yàn)室兩種模式動(dòng)物的視網(wǎng)膜神經(jīng)傳導(dǎo)通路特點(diǎn)有著重要的意義。為開(kāi)展相關(guān)研究，本文先后采用了木瓜蛋白酶急性分解和視網(wǎng)膜鋪片后切片兩種方法進(jìn)行視桿雙極細(xì)胞的鈣通道電流

4、的記錄。
　　材料與方法：
　　選取4-7周的SD大鼠。（1）使用木瓜蛋白酶急性分解的方法中，采用木瓜蛋白酶(papain，30,000USPu/mg，Calbiochem-Novabiochem)酶解獲得視桿雙極細(xì)胞，使用倒置顯微鏡、EPC10（Heka，Germany）及配套軟件Pulse8.6(Heka，Germany)來(lái)觀察細(xì)胞及膜片鉗記錄。（2）在使用視網(wǎng)膜鋪片后切片的方法中，使用手動(dòng)切片機(jī)（ST-20,Naris

5、hige,Tokyo,Japan）迅速將視網(wǎng)膜切成150微米的薄片。然后使用EPC10（Heka，Germany）配套軟件Pulse8.6(Heka，Germany)來(lái)進(jìn)行觀察細(xì)胞及膜片鉗記錄。
　　結(jié)果：
　　1．在木瓜蛋白酶急性分解的方法中，可以觀察到形態(tài)正常，數(shù)量較多的視桿雙極細(xì)胞。但是在記錄過(guò)程中，除一例細(xì)胞外，其余細(xì)胞均記錄不出L-Ca2+通道電流，但是可以正常記錄出GABA受體介導(dǎo)的電流。
　　2．在使用視

6、網(wǎng)膜鋪片后切片的方法中，可以觀察到清晰的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞層次，辨別出視桿雙極細(xì)胞，并且在記錄過(guò)程中，在視桿雙極細(xì)胞的胞體成功記錄出L-Ca2+通道電流。在實(shí)驗(yàn)中，慢電容補(bǔ)償（slowcapacitance）值為3.2±0.3pF（n=11）。階越（step）刺激:大小為31.1±3.3pA（n=11）。斜坡（ramp）刺激：大小為32.5±3.1pA（n=11）。
　　3．在得到穩(wěn)定的Ca2+電流之后，給予L-Ca2+通道阻斷劑ni

7、fedipine，濃度5μM，幾乎完全阻斷Ca2+電流。
　　結(jié)論：
　　1．木瓜蛋白酶急性分離的方法，未能記錄出L-Ca2+通道電流?？赡苡捎谝晽U雙極細(xì)胞軸突損傷，從而導(dǎo)致無(wú)法記錄出L-Ca2+通道電流。
　　2．視網(wǎng)膜鋪片后切片的方法，根據(jù)實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)，得到的電流，其電流的大小和性質(zhì)符合L-Ca2+通道電流的特點(diǎn)。通過(guò)相關(guān)藥物可阻斷視桿雙極細(xì)胞L-Ca2+通道的信號(hào)傳導(dǎo)。在本次實(shí)驗(yàn)中使用nifedipine，可以