nNOS源性NO對(duì)心肌細(xì)胞L-型鈣通道的抑制性保護(hù)作用.pdf

1、【背景】
　　近年來我國載人航天事業(yè)迅猛發(fā)展,航天員在軌時(shí)間逐步延長。但是長期暴露于失重環(huán)境下人體會(huì)出現(xiàn)立位耐力不良現(xiàn)象,這是由體液喪失、心肌收縮性能降低和血管發(fā)生適應(yīng)性重塑[1,2]三方面共同作用所導(dǎo)致。失重環(huán)境下體液喪失所致心臟前負(fù)荷下降是導(dǎo)致心肌收縮性能降低的重要原因,而失重具體通過哪種機(jī)制引起心肌收縮性能下降,盡管研究很多,目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)尾部懸吊大鼠心肌細(xì)胞神經(jīng)型一氧化氮合酶(neuronal nit

2、ric oxide synthase,nNOS)表達(dá)下降伴有活性降低。大量研究表明nNOS主要定位于心肌細(xì)胞的肌質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜,并作用于受磷蛋白(phospholamban,PLB)、雷諾啶受體(ryanodine receptor,RyR)、L-型鈣通道(L-type calcium channel,LTCC)等等位點(diǎn)[3],改變nNOS的表達(dá)量可以影響心肌的收縮與舒張功能[4]。LTCC作為興奮-收縮偶聯(lián)的關(guān)鍵步驟,我們推測失重條件下

3、nNOS表達(dá)量的降低可能通過改變LTCC門控特性影響心肌收縮性能,因此本研究通過建立尾部懸吊大鼠模型,主要研究nNOS對(duì)LTCC門控特性的影響。
　　【目的】
　　(1)分離存活比例高、功能好和保存時(shí)間長的心肌細(xì)胞。
　　(2)觀察4周模擬失重尾部懸吊大鼠(tail-suspended rats,SUS)及其同步對(duì)照(control,CON)組心肌nNOS表達(dá)量和活性變化,以及心肌LTCC(α1C)表達(dá)量的改變。

4、>　　(3)在SUS組和CON組心肌細(xì)胞,觀察一氧化氮(nitric oxide,NO)對(duì)LTCC通道門控特性及其對(duì)異丙腎上腺素(isoproterenol,ISO)反應(yīng)性的調(diào)節(jié)作用。
　　【方法】
　　利用本科室已建立的尾部懸吊大鼠模型模擬失重條件下心臟變化,western blot方法檢測SUS組和CON組心肌nNOS和LTCC(α1C)表達(dá)量的差異,熒光法檢測nNOS活性變化。采用膜片鉗實(shí)驗(yàn)方法全細(xì)胞模式檢測SUS組和

5、CON組心肌LTCC通道門控特性的變化,包括激活特性、失活特性和恢復(fù)特性。
　　【結(jié)果】
　　(1)大容量細(xì)胞保存液可以長時(shí)間維持心肌細(xì)胞功能
　　急性分離大鼠心肌細(xì)胞代謝旺盛,消耗保存液中營養(yǎng)物質(zhì)并產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物,導(dǎo)致小容量保存液(20ml)pH值逐漸降低,異常形狀細(xì)胞比例增加,細(xì)胞線粒體膜電位絕對(duì)值降低,細(xì)胞自發(fā)熒光逐漸由線粒體還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleo

6、tide,NADH)藍(lán)色熒光轉(zhuǎn)變?yōu)榧≡w維的綠色熒光,細(xì)胞ICa.L峰值幅度降低。大容量細(xì)胞保存液(100ml)營養(yǎng)物質(zhì)豐富,緩沖能力強(qiáng),可以長時(shí)間維持液體pH于穩(wěn)定水平,進(jìn)而維持線粒體膜電位,保持細(xì)胞長時(shí)間處于功能良好狀態(tài)。
　　(2)4周尾部懸吊大鼠心肌nNOS表達(dá)量與活性均降低;LTCC的α1C亞基表達(dá)量不變
　　Western blot方法檢測SUS組與CON組NOSs表達(dá)量的改變,結(jié)果顯示SUS組nNOS表達(dá)量顯著

7、下降,而內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)表達(dá)量無顯著變化。使用一氧化氮熒光探針DAF-FMDA檢測發(fā)現(xiàn):與CON大鼠相比,4wSUS組總NOS活性降低,nNOS活性降低,NO產(chǎn)生量減少。SUS組與CON組心肌LTCC的α1C亞基表達(dá)量之間無顯著差別。
　　(3)在異丙腎上腺素(ISO)刺激條件下,nNOS源性NO對(duì)心肌細(xì)胞LTCC具有抑制性保護(hù)作用
　　與CO

8、N組相比,SUS組基礎(chǔ)狀態(tài)下LTCC電流-電壓曲線(I-V曲線)左移且峰值增大,通道半激活電壓(Va0.5)絕對(duì)值增加,激活斜率因子(ka)不變,提示通道容易激活;穩(wěn)態(tài)失活50％對(duì)應(yīng)脈沖電壓與斜率因子不變,提示失活特性無差異;通道恢復(fù)時(shí)間常數(shù)(t)縮短,提示恢復(fù)加速。在ISO刺激下,CON組ICa.L峰值增加,通道半激活電壓絕對(duì)值增加,激活斜率因子降低,提示通道激活加速;穩(wěn)態(tài)失活50%對(duì)應(yīng)脈沖電壓(Vi0.5)與斜率因子(ki)未改變,

9、提示失活特性未改變;恢復(fù)時(shí)間常數(shù)縮短,提示恢復(fù)加快,恢復(fù)百分比增加,提示恢復(fù)充分;然而,SUS組ICa.L峰值增加幅值顯著低于CON組;SUS組通道半激活電壓絕對(duì)值較CON組減小,激活斜率因子高于CON組,提示SUS組通道激活減慢;穩(wěn)態(tài)失活50%對(duì)應(yīng)脈沖電壓絕對(duì)值高于CON組,斜率因子與CON組無差別,提示SUS組通道容易失活;恢復(fù)時(shí)間常數(shù)無差異,但是恢復(fù)百分比較CON組減小,提示通道恢復(fù)不充分,上述結(jié)果表明SUS組心肌細(xì)胞LTCC對(duì)I

10、SO反應(yīng)性降低且通道門控特性受損。
　　nNOS特異性抑制劑灌流5min后,與基礎(chǔ)狀態(tài)相比,CON組ICa.L峰值增加;半激活電壓絕對(duì)值增加,激活斜率因子無變化,提示通道容易激活;穩(wěn)態(tài)失活50%對(duì)應(yīng)脈沖電壓與斜率因子未改變,提示失活特性未改變;恢復(fù)時(shí)間常數(shù)縮短,提示恢復(fù)加速。nNOS特異性抑制劑和ISO聯(lián)合灌流5min,與單純ISO刺激相比,CON組ICa.L峰值降低;半激活電壓絕對(duì)值降低,激活斜率因子增加,提示通道激活減慢;穩(wěn)態(tài)

11、失活50%對(duì)應(yīng)脈沖電壓絕對(duì)值增加,斜率因子無差異,提示通道容易失活;恢復(fù)時(shí)間常數(shù)無差異,但是恢復(fù)百分比降低,提示恢復(fù)不充分。上述結(jié)果表明CON組nNOS被抑制后,LTCC對(duì)ISO反應(yīng)性降低且通道門控特性受損。
　　NO供體SNAP(S-nitroso-N-acetylpenicillamine)灌流5min后,與基礎(chǔ)狀態(tài)相比,CON組ICa.L峰值無差異;半激活電壓絕對(duì)值增加,激活斜率因子降低,提示通道激活加速;穩(wěn)態(tài)失活50%對(duì)應(yīng)

12、脈沖電壓與斜率因子未改變,提示失活特性無差異;恢復(fù)時(shí)間常數(shù)縮短,提示恢復(fù)加速。SNAP和ISO聯(lián)合灌流5min后,與單純ISO刺激相比,CON組ICa.L峰值降低;半激活電壓絕對(duì)值降低,激活斜率因子增加,提示通道激活減慢;穩(wěn)態(tài)失活50%對(duì)應(yīng)脈沖電壓與斜率因子未改變,提示失活特性無差異;通道恢復(fù)時(shí)間常數(shù)和恢復(fù)百分比均無差異。上述結(jié)果表明NO過多可抑制通道開放,降低ISO刺激下ICa.L增加幅度,但不損傷通道門控特性。
　　【結(jié)論】<