二甲基甲酰胺對(duì)心肌細(xì)胞L-型鈣電流影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：二甲基甲酰胺(DMF)是一種應(yīng)用極其廣泛的萬能有機(jī)溶劑,在各個(gè)制造行業(yè)大量使用,其對(duì)職業(yè)接觸人群健康影響也越來越大。目前研究較為深入的是DMF對(duì)肝臟的損傷而其對(duì)心臟損害的研究十分罕見,僅見于少量臨床病例報(bào)告中。課題組在前期的現(xiàn)場衛(wèi)生學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)DMF職業(yè)接觸者有明顯的心電圖異常和心律不齊表現(xiàn),動(dòng)物染毒實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)DMF會(huì)致使心肌細(xì)胞發(fā)生病變壞死及產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化等改變。為了研究DMF對(duì)心肌產(chǎn)生損害的機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)采用了全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)

2、記錄不同劑量的DMF作用后H9C2心肌細(xì)胞的L-型鈣電流通路變化,研究DMF對(duì)心肌細(xì)胞造成的電生理改變,初步探討DMF對(duì)心肌的毒性作用機(jī)制。
　　材料和方法：實(shí)驗(yàn)用心肌細(xì)胞系購于中科院上海細(xì)胞庫,為正常大鼠心肌細(xì)胞系(H9C2),實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí),消化并置于玻片上(細(xì)胞密度約為l105/ml),待2h后細(xì)胞完全貼壁加入含有10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液,在5%CO2、37oC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)24h后用含有

3、不同劑量DMF的新鮮培養(yǎng)液再次培養(yǎng)心肌細(xì)胞24h,用PBS緩沖液清洗三次后置于細(xì)胞外液中用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)。保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境在25oC左右,鏡下選擇貼壁良好、邊緣清晰、折光性良好的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。微電極采用兩步法拉制而成,充灌電極內(nèi)液后阻值在2-5MΩ。微電極經(jīng)電極夾持器與注射器相連,給正壓后浸入電極外液接觸心肌細(xì)胞,使用注射器給予負(fù)壓形成高阻封接,繼續(xù)施加負(fù)壓吸破細(xì)胞膜,形成全細(xì)胞記錄模式。在電壓鉗模式下,記錄低劑量組(140mM DMF染

4、毒組)、高劑量組(220mM DMF染毒組)的L-型鈣電流的變化,并與正常心肌細(xì)胞對(duì)照組進(jìn)行比較。鈣電流的記錄和刺激程序均由PatchMaster軟件完成,輸出信號(hào)經(jīng)HEKA EPC10 USB放大器放大。記錄的信號(hào)經(jīng)放大保存后,用配套的FitMaster分析軟件進(jìn)行處理,再經(jīng)相應(yīng)分析模塊得出相應(yīng)的圖形和數(shù)據(jù)。組間比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,數(shù)據(jù)處理使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。
　　結(jié)果：經(jīng)過具體分析后

5、發(fā)現(xiàn)三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的I-V曲線均在+20mV左右達(dá)到峰值,心肌細(xì)胞的L-型鈣電流的I-V曲線的形狀并沒有明顯改變,表明鈣電流的電壓依賴性沒有改變,但是隨著DMF的作用劑量增大,I-V曲線不斷上移,心肌細(xì)胞L-型鈣電流不斷減小。峰值電流密度比較顯示:對(duì)照組的平均峰值電流密度為-9.50±0.44 pA/pF（n=10),低劑量組(140mM DMF)的平均峰值電流密度為-4.43±0.46 pA/pF(n=10),峰值電流密度下降了53.37

6、%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。高劑量組(220mM DMF)的平均峰值電流密度為-2.37±0.23 pA/pF(n=10),相比較于對(duì)照組下降了75.05%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01)。高劑量組(220mM DMF)的平均峰值電流密度較低劑量組(140mM DMF)的平均峰值電流密度下降了46.50%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：DMF干預(yù)后,H9C2心肌細(xì)胞發(fā)生了一系列的電生理學(xué)方面的變化,L-