單克隆培養(yǎng)法分離、鑒定人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251干細(xì)胞.pdf

1、目的:研究人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251中腫瘤干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定方法。
　　 方法:將貼壁生長的U251細(xì)胞用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，1200rpm/min 離心5min后加入含有EGF、bFGF、N2、B27、L-glu及青鏈霉素的DMEM/F12 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以大于105/孔接種到24孔培養(yǎng)板中，以后逐日觀測腫瘤球生長情況，待腫瘤球形成并從板底脫落后，將腫瘤球吸出離心反復(fù)吹打至單細(xì)胞懸液，以每孔1-2個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96

2、孔板中行單克隆培養(yǎng)，以后動(dòng)態(tài)記錄形成次代腫瘤球的孔，同樣方法進(jìn)行培養(yǎng)三代腫瘤球。添加含血清的培養(yǎng)基行腫瘤球分化前后光鏡、電鏡形態(tài)以及細(xì)胞免疫熒光染色研究。
　　 結(jié)果:貼壁生長U251細(xì)胞在含各種因子及添加劑的無血清培養(yǎng)基中經(jīng)7天左右可以形成形狀較為規(guī)則的腫瘤球，單克隆培養(yǎng)三代腫瘤球所需時(shí)間明顯縮短至約48小時(shí)。添加含血清培養(yǎng)基后三代腫瘤球可以明顯分化，行免疫熒光染色腫瘤球可以表達(dá)Nestin 干細(xì)胞標(biāo)記物，分化后細(xì)胞可表達(dá)星型

3、膠質(zhì)細(xì)胞GFAP、神經(jīng)元β-TubulinⅢ等標(biāo)記物。單克隆培養(yǎng)形成的腫瘤球細(xì)胞分化前后的電鏡形態(tài)存在明顯差異。
　　 結(jié)論:在建系已久的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251中分離腫瘤干細(xì)胞可以避免原代培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞中混雜其他細(xì)胞的缺陷，單克隆培養(yǎng)出來的腫瘤干細(xì)胞形狀更為規(guī)則、細(xì)胞種類更為單一。單克隆培養(yǎng)法不失為一種簡便、有效分離干細(xì)胞的方法。
　　 U251 腫瘤球保持了干細(xì)胞球的特性，自我更新、多向分化潛能以及分化前后表達(dá)不同的