人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251光動(dòng)力瘤苗的制備及其體外細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤，其發(fā)病率占全部顱內(nèi)腫瘤的40％-50％，惡性度高，且呈浸潤性生長(zhǎng)，手術(shù)難以全切除，容易復(fù)發(fā)；又因中樞神經(jīng)特有的血腦屏障結(jié)構(gòu)以及腦組織對(duì)放射線的耐受性差等特點(diǎn)，所以傳統(tǒng)的手術(shù)加放療加化療的治療模式往往效果不好，治愈率極低而且并發(fā)癥較多，術(shù)后往往遺留神經(jīng)功能缺失，如偏癱、失語，甚至出現(xiàn)思維、情感障礙，尤其是復(fù)發(fā)率極高。據(jù)報(bào)道傳統(tǒng)的治療模式，惡性膠質(zhì)瘤病人的中位生存期不到一年[1]。因此，探索新的治療

2、方法和治療模式顯得格外重要，而各種腦膠質(zhì)瘤疫苗尤其是樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells DCs)疫苗的出現(xiàn)，使人們看到了曙光。 關(guān)于膠質(zhì)瘤的各種新型的治療模式層出不窮，近年來關(guān)于膠質(zhì)瘤的綜合免疫治療模式報(bào)道較多，尤其是關(guān)于膠質(zhì)瘤的DC疫苗方面，有的已經(jīng)報(bào)道用于臨床，效果較好；但膠質(zhì)瘤的DC疫苗仍然存在許多不足：比如沒有特異性好的腫瘤抗原，存在自身免疫性疾病的可能等。 腫瘤的光動(dòng)力治療(Photodynamic t

3、reatment PDT)以前認(rèn)為是一種利用腫瘤組織與光敏劑高度親和性的特點(diǎn)，通過一定波長(zhǎng)光激發(fā)滯于腫瘤組織的光敏劑，從而產(chǎn)生單態(tài)氧，破壞腫瘤細(xì)胞或者腫瘤血管，從而達(dá)到治療腫瘤的一種新方法[2]?，F(xiàn)在認(rèn)為PDT治療腫瘤時(shí)不僅僅只是利用單態(tài)氧發(fā)揮作用，還可以使細(xì)胞表面產(chǎn)生一些免疫改變：比如分泌IL-12、TNF-a等細(xì)胞因子，同時(shí)PDT作用誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)也可促進(jìn)應(yīng)急蛋白：如HSP70等的表達(dá)，然后通過激活核因子kB和AP-1，間接控制

4、多種細(xì)胞因子如：IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)、粒集落刺激因子(CSF)、Toll樣受體等及其免疫相關(guān)基因的表達(dá)，從而誘發(fā)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)[3-6]。本實(shí)驗(yàn)利用自體“血清+雞尾酒法”從正常成人外周血中分離、誘導(dǎo)成熟的DCs作為抗原呈遞細(xì)胞，將光動(dòng)力處理過的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251所發(fā)生的細(xì)胞表面免疫表達(dá)以及免疫改變信息獲取，從而制備成膠質(zhì)瘤的光動(dòng)力疫苗，并通過體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)和普通的凍融疫苗以及熱休克疫苗的殺傷效應(yīng)作比較。

5、 研究目的： 1.制備膠質(zhì)瘤兩種光動(dòng)力疫苗； 2.在體外證明光動(dòng)力疫苗的細(xì)胞毒效應(yīng)。 材料與方法： 1.人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251對(duì)光敏劑HMME(血卟啉單甲醚)的吸收以及排泄特性的研究： 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的U251與不同濃度的光敏劑HMME分別孵育不同的時(shí)間，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)孵育后細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，間接推測(cè)細(xì)胞內(nèi)的光敏劑濃度，了解人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251對(duì)光敏劑HMME的吸收以及排泄的特性，從而

6、確定U251細(xì)胞孵育的光敏劑濃度以及孵育時(shí)間，以達(dá)到下游實(shí)驗(yàn)需要的細(xì)胞內(nèi)光敏劑最佳濃度，并且希望確定細(xì)胞內(nèi)的光敏劑開始排泄的時(shí)間，指導(dǎo)臨床治療病人的避光時(shí)間。 2.HMME-PDT時(shí)不同功率密度對(duì)U251的光動(dòng)力效應(yīng)的影響： 取已和光敏劑孵育達(dá)到最佳細(xì)胞內(nèi)光敏劑濃度的U251細(xì)胞用He-Ne連續(xù)性激光逐孔照射，調(diào)定各組能量密度不同，照射后用MTT法檢測(cè)各組各孔細(xì)胞死亡率，同時(shí)設(shè)定無激光照射和無光敏劑的空白對(duì)照組和單用激光

7、照射和單用光敏劑的陰性對(duì)照組，從而確定不同功率密度對(duì)光動(dòng)力效應(yīng)的影響。 3.人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的培養(yǎng)以及各種抗原的提取和制備： 取足夠數(shù)目(107以上)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞，分成四組用四種不同的方法制備各種抗原；①組：凍融抗原：凍融法提取全細(xì)胞抗原；②組：熱休克抗原：利用“熱休克法”提取熱休克抗原；③組：光動(dòng)力全細(xì)胞抗原：利用上游實(shí)驗(yàn)確定好的能量密度的激光照射已和光敏劑孵育過的達(dá)到細(xì)胞內(nèi)光敏劑濃度最佳的U251細(xì)

8、胞，再用高速離心法提取光動(dòng)力處理后死細(xì)胞的全細(xì)胞抗原：④組：光動(dòng)力細(xì)胞表面抗原：用弱酸洗脫法提取光動(dòng)力處理后活細(xì)胞表面的洗脫抗原。 4.“自體血清+雞尾酒法”分離誘導(dǎo)外周血DCs成熟的研究： 取正常成人外周血約180ml，分成三組分離DCs并誘導(dǎo)其成熟：①：經(jīng)典脂多糖(Lipopolysaccharid LPS)誘導(dǎo)組：從外周血分離單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells PBMC

9、s)，用RPMI1640+FBS(胎牛血清)的完全培養(yǎng)基接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，兩小時(shí)后棄懸浮細(xì)胞，將貼壁單個(gè)核細(xì)胞，用GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor)和IL-4(Imerleukin-four)，培養(yǎng)，培養(yǎng)到第6天時(shí)加入LPS誘導(dǎo)24小時(shí)收集；②：“雞尾酒”誘導(dǎo)組：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞的分離及培養(yǎng)同①組，培養(yǎng)到第6天時(shí)用細(xì)胞因子組合(1000U／ml TNF-α、

10、10ng／ml IL-6、10ng／mlIL-β、1ug／ml PGE2)誘導(dǎo)24小時(shí)收集；③：自體血清+“雞尾酒”誘導(dǎo)組：從外周血分離PBMC后，用RPMI1640+10％自體血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)方法同②組。將以上三組分離、誘導(dǎo)的外周血DCs在純度、成熟度、形態(tài)上以及刺激淋巴細(xì)胞增殖能力上做比較。 5.DCs的“自體血清+雞尾酒法”分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)成熟以及四種瘤苗的制備： 首先用“自體血清+雞尾酒法”從外周血分離出

11、足量未成熟DCs，第6天分組誘導(dǎo)成熟，①：凍融抗原負(fù)載誘導(dǎo)組：凍融法制備的腫瘤細(xì)胞抗原負(fù)載聯(lián)合雞尾酒法誘導(dǎo)成熟DCs；②：熱休克抗原負(fù)載誘導(dǎo)組：熱休克法制各的腫瘤細(xì)胞抗原負(fù)載聯(lián)合雞尾酒法誘導(dǎo)成熟DCs；③：光動(dòng)力全細(xì)胞抗原負(fù)載誘導(dǎo)組：光動(dòng)力法制備的全細(xì)胞抗原負(fù)載聯(lián)合雞尾酒法誘導(dǎo)成熟DCs；④：光動(dòng)力洗脫抗原負(fù)載誘導(dǎo)組：光動(dòng)力法制備的沈脫抗原負(fù)載聯(lián)合雞尾酒法誘導(dǎo)成熟DCs。各組均在誘導(dǎo)24小時(shí)后收獲DCs用于下游細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)。 6.

12、淋巴細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和篩選以及各種瘤苗誘導(dǎo)特異性CTL細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)： 參照文獻(xiàn)報(bào)道用尼龍毛柱分選法分選外周血分離的非貼壁的單核細(xì)胞(主要是淋巴細(xì)胞)，分選后的淋巴細(xì)胞于24孔板用添加了100U／ml IL-2的RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，用于下游實(shí)驗(yàn)；將上游實(shí)驗(yàn)各組制備的成熟的經(jīng)過抗原負(fù)載的DCs 2×105／ml與分選過的淋巴細(xì)胞(主要為T淋巴細(xì)胞)共培養(yǎng)5天，成為免疫效應(yīng)細(xì)胞；然后再和靶細(xì)胞U251共培養(yǎng)24小時(shí)，用MT

13、T法檢測(cè)靶細(xì)胞的存活率，從而比較各組瘤苗的體外細(xì)胞毒效應(yīng)。實(shí)驗(yàn) 結(jié)果： 1.人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251對(duì)光敏劑HMME(血卟啉單甲醚)的吸收、代謝以及排出特性：流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果表明：當(dāng)光敏劑濃度恒定為40ug／ml時(shí)，隨著孵育時(shí)間的增加，細(xì)胞內(nèi)光敏劑濃度總體趨勢(shì)是增加的，但到了36小時(shí)后總體趨勢(shì)是下降的，說明細(xì)胞內(nèi)光敏劑已經(jīng)開始排泄，并且2小時(shí)內(nèi)增加趨勢(shì)明顯，2小時(shí)后增加趨勢(shì)明顯變緩，各組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)孵育時(shí)間恒定為

14、2小時(shí)，隨著的光敏劑濃度增加，細(xì)胞內(nèi)光敏劑濃度總體趨勢(shì)是增加的，并且在增加到40ug／ml前趨勢(shì)明顯，之后明顯變緩。 2.HMME-PDT時(shí)不同功率密度對(duì)U251的光動(dòng)力效應(yīng)的影響： 在光敏劑濃度和孵育時(shí)間恒定的情況下，隨著功率密度的增加，U251細(xì)胞的存活率明顯下降；當(dāng)功率密度達(dá)到2.4J／cm2時(shí)，死亡率幾乎為50％，當(dāng)功率密度達(dá)到7.2J／cm2時(shí)，死亡率幾乎為100％；單用激光對(duì)U251的死亡率沒有影響，單用光敏

15、劑，在光敏劑濃度不超過40ug／ml時(shí)，對(duì)U251細(xì)胞沒有毒性作用。 3.“自體血清+雞尾酒法”誘導(dǎo)外周血DCs的成熟度、純度以及刺激淋巴細(xì)胞增殖能力分析：“自體血清+雞尾酒法”誘導(dǎo)的DC成熟過程中形態(tài)好、突起多；成熟表型CD80、CD86、CD83以及HLA-DR的平均表達(dá)率分別是88.60％、50.55％、73.89％、93.24％，明顯高于其它兩組，提示自體血清+“雞尾酒法”誘導(dǎo)組的DC細(xì)胞純度及成熟度均最高；激活淋巴細(xì)胞

16、增殖指數(shù)為2.03，明顯高于其它兩組。 4.四組瘤苗的體外對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)比較結(jié)果： 通過MTT檢測(cè)結(jié)果表明：四組瘤苗的體外對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)大小分別是洗脫組>全細(xì)胞抗原組>熱休克抗原組>凍融抗原組。 結(jié)論： 1.人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251對(duì)光敏劑HMME的吸收量是與孵育時(shí)間(≦2h)和光敏劑濃度(≦40ug／ml)成正相關(guān)。 2.在一定條件下，PDT效應(yīng)與能量密度成正相關(guān)；單用激光對(duì)細(xì)胞無殺傷