人腦膠質瘤細胞誘導分化基因譜的建立及相關基因的克隆.pdf

1、蘇州大學博士學位論文人腦膠質瘤細胞誘導分化基因譜的建立及相關基因的克隆姓名：孫立軍申請學位級別：博士專業(yè)：外科學指導教師：杜子威黃強2001.4.1●八碴皎囊瘤鏹瞻誘導分化基因譜的建立及相關基函的克隆中文摘要常規(guī)培養(yǎng)膠質瘤細胞。原代培養(yǎng)正常腦組織。在相差顯微鏡下用虹吸管吸取單個SHG44細胞，加滋養(yǎng)細胞共培養(yǎng)，建立單克隆的膠質瘤細胞株。2分化劑的篩選和分化程度鑒定。用MTT法檢測細胞增殖能力，常規(guī)Giemsa染色或H—E染色觀察細胞形態(tài)

2、，雙層軟瓊脂法檢測克隆形成率，流式細胞術測細胞周期動力學，免疫熒光測GFAP表達，劃痕法檢測細胞運動能力。3cDNAarray技術建立誘導分化基因譜。應用BioRobotics公司的自動點膜儀制各cDNAarray膜(挑克隆，搖菌，抽質粒，PCR，點膜)，抽提RNA，分離mRNA，用Q33PdATP標記成探針，與array膜雜交，結果用磷屏信號掃描分析，多點雜交驗證。4隨機引物差異展示技術克隆膠質瘤誘導分化相關基因。對苯丁酸鈉誘導前后的

3、膠質瘤細胞抽提RNA，用隨機引物進行逆轉錄和PCR，摻入Q32PdCTP，PAGE電泳，放射自顯影?；厥詹U增差異條帶，SSCP純化，dotblot、Northernblot驗證，最后克隆差異基因片段，測序，生物信息學分析。【結果】1三個細胞株的特征和正常星形膠質細胞的培養(yǎng)：單細胞接種7天后，共得到25個克隆，命名為SHG一44一i至SHG一44—25。以其中的9號、17號、15號分別代表高、中、低分化，作重點觀察。在形態(tài)學、DNA含量