DNMT1基因表達(dá)減少對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖,克隆和周期影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：應(yīng)用靶向DNMT1基因的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，觀察其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，克隆和周期的影響，為臨床在基因水平上治療膠質(zhì)瘤提供方法和依據(jù)。
　　方法：利用免疫組化（immunohistochemistry，IHC)技術(shù)對(duì)62例不同級(jí)別人腦膠質(zhì)瘤組織中DNMT1基因的表達(dá)及與病理分級(jí)相關(guān)性進(jìn)行檢測(cè)并分析。用以靶向DNMT1的siRNA轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的兩種人腦

2、膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（A172和U87），敲減膠質(zhì)瘤細(xì)胞株內(nèi)DNMT1基因，將其設(shè)為轉(zhuǎn)染組（實(shí)驗(yàn)組），并將其實(shí)驗(yàn)結(jié)果和僅予以轉(zhuǎn)染siRNA陰性對(duì)照序列的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（對(duì)照組）的實(shí)驗(yàn)結(jié)果做比較并進(jìn)行相關(guān)分析。應(yīng)用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)（quantificational real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）分析DNMT1基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)的變化；蛋白質(zhì)印跡法（Western blot，wb）

3、分析DNMT1，PCNA和Cyclin D1蛋白表達(dá)變化；采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖和克隆形成能力情況；應(yīng)用流式細(xì)胞分析法（Flow cytometry，F(xiàn)c）檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。觀察DNMT1基因表達(dá)減少后對(duì)A172和U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、克隆形成和周期分布的影響。
　　結(jié)果：免疫組化結(jié)果顯示，不同級(jí)別人腦膠質(zhì)瘤組織中DNMT1基因表達(dá)均異常上調(diào)，且與膠質(zhì)瘤臨床病理分級(jí)呈正相關(guān)（P<0.05）。在A1

4、72和U87的膠質(zhì)瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組比較，定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)表明實(shí)驗(yàn)組中DNMT1 mRNA表達(dá)明顯減少（P<0.01）；蛋白質(zhì)印跡法表明實(shí)驗(yàn)組DNMT1，PCNA和Cyclin D1蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.01）；MTT法檢測(cè)表明實(shí)驗(yàn)組中活的膠質(zhì)瘤細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組（P<0.05）；細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)驗(yàn)組中膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆形成能力和對(duì)照組相比較明顯受到抑制（P<0.01）；流式細(xì)胞分析法顯示，實(shí)驗(yàn)組中的膠質(zhì)瘤細(xì)胞