基于分子探針的腫瘤細胞p53mRNA定量檢測及點突變檢測研究.pdf

1、惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康的疾病之一，越來越多的研究表明惡性腫瘤發(fā)生過程與細胞內相關基因表達水平的改變具有密切聯(lián)系。因此，建立快速、準確、靈敏檢測基因表達水平的方法，對于腫瘤的發(fā)病機理研究、早期診斷和治療具有重要意義。本論文設計了具有特異識別功能的熒光分子探針，發(fā)展了在基因水平上定量研究腫瘤細胞p53mRNA表達與點突變檢測的體系，主要開展了以下三方面的研究工作：1、根據(jù)p53抑瘤基因的堿基序列，設計了能特異性檢測p53mRNA的分子信

2、標(molecularbeacon，MB)，發(fā)展了一種快速定量測定細胞內總RNA提取物中p53mRNA的方法。采用鼻咽癌細胞系(CNE2)和經RNA干擾技術降低p53基因表達的細胞系(CNE2-p53RNAi)為樣本，抽提其總RNA并用MB檢測。建立了p53/cDNA標準曲線，將其應用于多種腫瘤細胞內p53基因表達水平的分析，表達變化趨勢與經典的mRNA分析方法RT-PCR檢測結果相符。這種方法簡單、靈敏、快速、安全，可以用于不同細胞中

3、p53mRNA的體外定量檢測。 2、根據(jù)已建立的分子信標定量檢測p53mRNA的方法，考察了用5-氟尿嘧啶(5-FU)作用不同時間后肺腺癌細胞(A549)中p53mRNA表達水平的變化，并結合傳統(tǒng)分子生物學方法研究該基因轉錄水平變化對細胞增殖的影響及可能機制，驗證了分子信標快速檢測mRNA方法的可靠性和實用性。結果表明：藥物作用后能誘導A549細胞中p53mRNA表達上調，且作用6小時后p53mRNA表達最高，但隨著藥物作用時間

4、的進一步增加，p53mRNA表達降低。該方法快速、準確、成本低，能夠快速地獲知該藥物對細胞內p53mRNA表達影響的信息，有望為腫瘤的個體化治療快速、準確地提供合理用藥的參考依據(jù)。 3、根據(jù)p53基因的堿基序列設計熒光基團四甲基羅丹明標記的核酸探針(熒光探針)和熄滅基團4'-(4'-二甲基氨基疊氮苯)苯甲酸標記的核酸探針(熄滅探針)，基于熒光共振能量轉移原理和RNaseH能降解RNA與DNA雜交體中RNA模板這一特點，發(fā)展了一種