超順磁性殼聚糖明膠微球載BMP-,9-和VEGF-,165-基因促進骨缺損愈合的初步研究.pdf

1、目的：觀察振蕩磁場和/或靜磁場下超順磁性殼聚糖明膠微球載VEGF165和/或BMP9基因?qū)Υ龠M生物活性人工骨血管化和骨缺損愈合的作用。 方法：（1）制備大量能夠在真核細胞中表達人BMP9和人VEGF165的質(zhì)粒。分別用PvuⅡ、SalⅠ和SacⅡ、HandⅢ雙酶切后，行瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定，并對質(zhì)粒進行DNA序列測定，用SmartSpecTM3000核酸蛋白測定儀測定其濃度和純度。（2）用化學(xué)共沉淀法制備超順磁性殼聚糖納米微球

2、（SPFCN），掃描電鏡和振動樣品磁強計等儀器對合成的SPFCN進行形態(tài)觀察和結(jié)構(gòu)表征。（3）用交聯(lián)固化法制備超順磁性殼聚糖質(zhì)粒明膠微球（SPCPGM）。（4）用納米羥基磷灰石/聚酰胺骨水泥（四川大學(xué)納米生物材料研究中心提供）制備中空帶側(cè)孔的仿兔橈骨中段骨缺損修復(fù)支架，將一定量的兩種超順磁性殼聚糖質(zhì)粒明膠微球分別填入中空支架中。（5）選用新西蘭兔48只，建立兔橈骨雙側(cè)骨缺損模型，隨機分為（A組）SPCPGM（BMP9+VEGF165）+

3、振蕩磁場+靜磁場；（B組）SPCPGM（BMPg+VEGF165）+靜磁場；（C組）SPCPGM（VEGF165）+振蕩磁場+靜磁場；（D組）SPCPGM（VEGF165）+靜磁場。術(shù)后2周、4周、8周、12周，搜集標(biāo)本，通過大體觀察，X線檢測，組織切片光學(xué)顯微鏡觀察，求積儀測量和計算機圖像分析系統(tǒng)分析等方法對生物活性人工骨血管化和成骨情況進行定性及定量測定，將獲得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，以評估四種不同處理組成骨的情況。 結(jié)果：（

4、1）兩種質(zhì)粒（pAdTRACKBMP9.pDsVEGF165）經(jīng)擴增、純化后，PvuⅡ、SalⅠ和SacⅡ、HandⅢ雙酶切瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定顯示：BMPg片段大?。?290bp），VEGF165片段大小（573bp）與預(yù)期相符；基因序列測定結(jié)果表明，基因序列正確。用SmartSpecTM3000核酸蛋白測定儀檢測BMPg質(zhì)粒濃度為0.49±0.09mg/ml；VEGF165質(zhì)粒濃度為0.37±0.06mg/ml。（2）掃描電鏡下F

5、e3O4納米粒外形呈橢圓形或圓形，均勻度好，粒徑為23；3.47nm。振動樣品磁強計檢測顯示制備的超順磁納米微球具有超順磁性。（3）制備SPCPGM時，SPFCN與pAdTRACKBMP質(zhì)粒和pDsVEGF165質(zhì)粒結(jié)合時的最適氮/磷（N/P）比例為2.5/1。（4）磁場（振動磁場和/或靜磁場）下SPCPGM促進人工骨成骨的體內(nèi)實驗研究表明：①SPCPGM（BMP9+VEGF165）促進生物活性人工骨血管化和成骨作用效果，優(yōu)于單獨使用S

6、PCPGM（VEGF165）。②靜磁場和振動磁場聯(lián)合應(yīng)用，能夠明顯提高SPCPGM體內(nèi)局部成骨作用，4周時已有大量成骨。③促進成骨的作用的順序：1）SPCPGM（BMP9+VEGF165）+振蕩磁場+靜磁場；2）SPCPGM（VEGF165）+振蕩磁場+靜磁場；3）SPCPGM（BMP9+VEGF165）+靜磁場≈4）SPCPGM（VEGF165）+靜磁場。④振動磁場的應(yīng)用，能夠促使局部磁性微球殘留量的明顯減少。 結(jié)論：超順磁性