振蕩磁場促超順磁性明膠質粒(pDsVEGF-,165-Red1-N1)微球的制備及體內活性的初步研究.pdf

1、目的：制備超順磁性殼聚糖質粒明膠微球（SPCPGM），在體外研究不同磁場強度、不同頻率的脈沖振蕩磁場作用下，與質粒（pDsVEGF165Red1-N1）基因釋放的量效關系。初步在體內進行活性實驗研究，為超順磁性明膠載藥微球的體內研究及臨床應用提供實驗依據(jù)。 方法：（1）用化學共沉淀法制備超順磁性四氧化三鐵殼聚糖納米粒（SPFCN），用透射電鏡、X-射線衍射儀、Zeta電位分析儀和振動樣品磁場計等對制備的SPFCN進行形態(tài)觀察和結

2、構表征。（2）制備大量能夠在真核細胞中表達人VEGF165的質粒（pDsVEGF165Red1-N1）。對質粒進行DNA序列測定，用SmartSpecTM3000核酸蛋白測定儀測定其濃度。（3）制備超順磁性四氧化三鐵殼聚糖納米粒質粒（pDsVEGF165Red1-N1）復合物。（4）用交聯(lián)固化法制備超順磁性四氧化三鐵殼聚糖質粒明膠微球（SPCPGM）和超順磁性殼聚糖明膠微球（SPCGM）。用納米羥基磷灰石/聚酰胺骨水泥（由四川大學納米生

3、物材料研究中心提供）制備中空帶側孔的仿兔橈骨中段骨缺損修復支架。將一定量的兩種微球分為（A組）SPCPGM+振蕩磁場，（B組）非磁性的SPCPGM+振蕩磁場，（C組）SPCGM+中空支架+振蕩磁場，其中A組和B組的微球包于雙層紗布中，C組的微球裝于支架中；在37℃下，用溶出度測定儀的轉藍法測質粒的釋放度，采用模擬人工體液（pH7.4）介質進行體外藥物釋放試驗，用核酸蛋白測定儀測定質粒的釋放量。（5）選用新西蘭大白兔48只，建立兔橈骨雙側

4、骨缺損模型，隨機分為（A組）SPCPGM+中空支架+振蕩磁場，（B組）SPCPGM+中空支架，（C組）SPCGM+中空支架+振蕩磁場；術后2周、4周、6周、8周、12周，搜集標本，通過大體觀察，生血管情況進行定性及定量測定，以評估三種不同處理組促進新生血管的情況。 結果：（1）透射電鏡下Fe3O4納米粒外形呈圓形或橢圓形，均勻度好，粒徑小于30nm；氮含量為0.0058mg/L。SPFCN表面帶正電荷（69.8±5.1mV）。振

5、動樣品磁場計結果顯示：SPFCN具有超順磁性。（2）質粒（pDsVEGF165Red1-N1）經(jīng)擴增、純化后，用瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定顯示：VEGF165片段大小與預期的相符，基因序列測定結果表明，基因序列正確。用SmartSpecTM3000核酸蛋白測定儀檢測質粒濃度為0.28±0.05 mg/ml。（3）復合后的SPCPN Zeta電位為26.7±4mV，仍帶正電荷。（4）振蕩磁場下SPCPGM體外質粒釋放實驗顯示：SPCPGM具有

6、藥物緩釋功能，釋藥時間超過三周。振蕩磁場能夠促進SPCPGM質粒釋放的速率，25天時使藥物釋放量提高到3倍。 結論：振動磁場下SPCPGM促進人工骨血管化的體內實驗研究表明：①SPCPGM具有促進體內局部成血管及成骨作用，而SPCGM幾乎沒有這個作用。②振動磁場的應用，能夠明顯提高SPCPGM體內局部成血管及成骨的作用，4周時成血管量達到最高峰，6周有大量的骨長成。③促進血管生成及成骨的效能依次為：SPCPGM+中空支架+振蕩磁