超順磁性殼聚糖質(zhì)粒（pDsVEGF-,165-Red1-N1）明膠控釋微球促進(jìn)人工骨血管化的初步研究.pdf

1、目的：制備超順磁性殼聚糖質(zhì)粒明膠微球(SPCPGM)，將其與生物活性人工骨復(fù)合，在體外觀測(cè)SPCPGM在外磁場(chǎng)(靜磁場(chǎng)和／或振蕩磁場(chǎng))的作用下控釋、濃聚質(zhì)粒的功能；在體內(nèi)觀測(cè)SPCPGM在外磁場(chǎng)(靜磁場(chǎng)和／或振蕩磁場(chǎng))下促進(jìn)生物活性人工骨血管化及成骨的作用。評(píng)估振蕩磁場(chǎng)和／或靜磁場(chǎng)下SPCPGM促進(jìn)人工骨血管化及成骨的效果，初步探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。 方法：(1)用化學(xué)共沉淀法制備超順磁性殼聚糖納米球(SPFCN)，用掃描電鏡、紅

2、外光譜儀、X一光衍射儀、Zeta電勢(shì)分析儀和磁力天平對(duì)合成的SPFCN進(jìn)行形貌觀察和結(jié)構(gòu)表征。(2)制備大量能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)人VEGFl65(hVEGFi65)-紅色熒光融合蛋白(RFP)質(zhì)粒(pDsVEGFl65Redl．N1)。用SacII、HandIII雙酶切后行瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定，并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測(cè)定，用SmartSpecTM3000核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其純度和濃度。(3)制備超順磁性殼聚糖質(zhì)粒(pDsVEGFl65

3、Redl—N1)復(fù)合物(SPCPN)。用瓊脂糖凝膠電泳考察其結(jié)合質(zhì)粒DNA的能力；用磁力天平測(cè)試其磁感應(yīng)性。通過(guò)在靜磁場(chǎng)下，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC一1)和人成骨肉瘤細(xì)胞(MG-63)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，用倒置熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀及原子吸收光譜儀測(cè)定，觀測(cè)靜磁場(chǎng)促進(jìn)SPCPN細(xì)胞轉(zhuǎn)染的作用。(4)用交聯(lián)固化法制備超順磁性殼聚糖質(zhì)粒明膠微球(SPCPGM)、非磁性殼聚糖質(zhì)粒明膠微球(CPGM)和不含質(zhì)粒的超順磁性殼聚糖明膠微球(SPCGM)。

4、用納米羥基磷灰石／聚酰胺骨水泥(由四川大學(xué)納米生物材料研究中心提供)制備中空帶側(cè)孔的仿兔橈骨中段骨缺損修復(fù)支架，將一定量的三種微球分別填入中空支架中，在37℃下，用0．0lMPBS(pH7．4)溶劑行體外藥物釋放試驗(yàn)，用振蕩磁場(chǎng)干預(yù)，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定質(zhì)粒的釋放量，觀測(cè)振蕩磁場(chǎng)促進(jìn)SPCPGM中質(zhì)粒釋放的作用。用自制的塑料槽為溶出試驗(yàn)容器，將含有一定量微球的支架固定于塑料槽中部。靜磁場(chǎng)下，在醋酸胃酶溶液中進(jìn)行體外質(zhì)粒溶出試驗(yàn)，研究靜磁

5、場(chǎng)局部濃聚質(zhì)粒的效果。(5)選用新西蘭大白兔48只，建立兔橈骨雙側(cè)骨缺損模型，隨機(jī)分為(A組)SPCPGM+靜磁場(chǎng)+振蕩磁場(chǎng)；(B組)SPCPGM+靜磁場(chǎng)；(C組)單純應(yīng)用SPCPGM；(D組)CPGM。術(shù)后2周、4周、6周、8周、12周、16周，搜集標(biāo)本，通過(guò)大體觀察，缺損處影像學(xué)檢測(cè)，組織切片光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡觀察，求積儀測(cè)量和計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分析等方法對(duì)缺損處新生血管和成骨情況進(jìn)行定性及定量測(cè)定，將所獲得的

6、數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以評(píng)估四種不同處理組新生血管及成骨的情況。 結(jié)果：(D掃描電鏡下Fe304納米粒外形呈圓形或橢圓形，均勻度好，粒徑范圍在7-20nm；SPFCN平均粒徑：46+24nm，氮含量為0．007mg／L。SPFCN表面帶正電荷(70．5+5．3mV)。磁力天平檢測(cè)結(jié)果顯示：SPFCN具有超順磁性質(zhì)。(2)質(zhì)粒(pDsVEGFj65Redl—N1)經(jīng)擴(kuò)增、純化后，SacII、HandIII雙酶切瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定

7、顯示：VEGF165片段大小與預(yù)期(573bp)相符，基因序列測(cè)定結(jié)果表明，基因序列正確。用SmartSpecTM3000核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)質(zhì)粒濃度為0．3+0．05mg／ml。(3)用瓊脂糖凝膠電泳分析SPFCN完全結(jié)合質(zhì)粒(pDsVEGFl65Redl．N1)時(shí)的氮／磷(N／P)比例為2．5／1，組裝后SPCPN的Zeta電位為27．8+4mV，仍帶正電荷。(4)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC．1)和人成骨肉瘤細(xì)胞(MG-63)轉(zhuǎn)染實(shí)

8、驗(yàn)顯示：在靜磁場(chǎng)下，轉(zhuǎn)染率分別為21．6％和9．35％，明顯高于裸質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染率4．5％和3％。提示靜磁場(chǎng)能夠促進(jìn)SPCPN的細(xì)胞轉(zhuǎn)染，其轉(zhuǎn)染效率可提高3-5倍。(5)振蕩磁場(chǎng)下SPCPGM體外質(zhì)粒溶出實(shí)驗(yàn)顯示：SPCPGM在多孔骨植入體中具有藥物緩釋功能，釋藥時(shí)間超過(guò)三周。振蕩磁場(chǎng)能夠增加多孔骨植入體中SPCPGM質(zhì)粒釋放速率，25天時(shí)使藥物釋放量提高到4-6倍。(6)靜磁場(chǎng)下SPCPGM中質(zhì)粒濃聚實(shí)驗(yàn)顯示：200mT(毫特斯拉)的靜磁

9、場(chǎng)下，塑料槽內(nèi)溶出液中DNA濃度由內(nèi)向外呈梯度遞減分布，在3-5cm處DNA濃度有明顯遞減現(xiàn)象，與CPGM相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0．05)。(7)磁場(chǎng)(振動(dòng)磁場(chǎng)和／或靜磁場(chǎng))下SPCPGM促進(jìn)人工骨血管化的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明：①SPCPGM與CPGM一樣具有促進(jìn)體內(nèi)局部成血管及成骨作用，兩者效率相近。②靜磁場(chǎng)能夠促進(jìn)SPCPGM體內(nèi)局部成血管及成骨作用，效果優(yōu)于單純使用SPCPGM或CPGM。③靜磁場(chǎng)和振動(dòng)磁場(chǎng)聯(lián)合應(yīng)用，能夠明顯提高

10、SPCPGM體內(nèi)局部成血管及成骨作用，6周時(shí)成血管量達(dá)到最高峰并大量成骨。④振動(dòng)磁場(chǎng)的應(yīng)用，能夠促使局部磁性微球殘留量的明顯減少，這對(duì)避免局部藥物殘留可能造成的近期或遠(yuǎn)期的不良后果具有重要意義。⑤促進(jìn)血管生成及成骨的效能依次為：SPCPGM+靜磁場(chǎng)+振蕩磁場(chǎng)>SPCPGM+靜磁場(chǎng)>磁性基因微球≈非磁性基因微球。 結(jié)論：1．納米Fe304殼聚糖具有超順磁性能，靜磁場(chǎng)下能夠濃聚質(zhì)粒DNA并能促進(jìn)其轉(zhuǎn)染細(xì)胞：2．超順磁性殼聚糖質(zhì)粒(p