利用BMP-膠原絲和BMSC-明膠微球構(gòu)建大尺寸生物仿生骨組織.pdf

1、微構(gòu)技術(shù)構(gòu)建大尺寸組織在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域（特別是骨組織工程方面）已被廣泛應(yīng)用。我們則是利用由大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)、cultispher-s明膠微球構(gòu)成的細(xì)胞單元和由骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bonemorphogenetic protein，BMP)和有序膠原絲構(gòu)成的分化調(diào)控單元來(lái)構(gòu)建厘米級(jí)的生物仿生骨組織。
　　細(xì)胞單元為BMSCs和cultispher-s明膠

2、微球在細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)7天后所獲得的長(zhǎng)滿細(xì)胞的微組織。方法為BMSCs以5×104/ml的密度接種到上述細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)基補(bǔ)至500ml;37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中間歇攪拌接種(off30min，on3min，30r/min)，8h后將磁力攪拌器調(diào)為50r/min連續(xù)攪拌，每2天全量換液1次，7天后收獲細(xì)胞單元。實(shí)驗(yàn)證明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠很好地接種到cultispher-s膠原微球，并在微球上迅速擴(kuò)增。
　　分化調(diào)控單元?jiǎng)t是

3、由有序膠原絲和實(shí)驗(yàn)室制備的與膠原具有特殊結(jié)合區(qū)域的BMP（簡(jiǎn)稱CBD-BMP）構(gòu)成。有序膠原絲具有很好的有序結(jié)構(gòu)和生物相容性，且無(wú)體外致突變性。CBD-BMP是將膠原結(jié)合區(qū)(collagen-binding domain，CBD)融合入骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)，通過(guò)體外活性以及LOCS特異結(jié)合能力檢測(cè)，說(shuō)明CBD結(jié)合區(qū)并不影響因子的活性，而且可以特異地與膠原結(jié)合，靶向錨定在LOCS上

4、并發(fā)揮作用。CBD-BMP與LOCS特異性結(jié)合，構(gòu)建分化調(diào)控單元。
　　體外實(shí)驗(yàn)我們把細(xì)胞單元和分化調(diào)控單元的混合物進(jìn)行連續(xù)灌注培養(yǎng)10天，以同樣條件灌注培養(yǎng)細(xì)胞單元作為對(duì)照組。經(jīng)過(guò)10天的連續(xù)灌注培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均形成了直徑為2厘米，高為1.1厘米的大尺寸生物仿生骨組織。形態(tài)學(xué)觀察可知大尺寸生物仿生骨組織具有較高的細(xì)胞密度，且細(xì)胞分布均勻，死細(xì)胞較少。ALP染色、茜素紅染色、ALP活性檢測(cè)、鈣離子含量測(cè)定等均發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組在鈣沉

5、積、ALP活性等方面顯著優(yōu)于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組連續(xù)灌注培養(yǎng)出的生物仿生骨組織更加接近正常骨組織。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)則是用1ml注射器把細(xì)胞單元和分化調(diào)控單元混合后注入到SD大鼠（200-225g）背部皮膚下，同樣以單注入細(xì)胞單元作為對(duì)照組。SD大鼠在相同的飼養(yǎng)條件下生長(zhǎng)30天。30天后，用戊巴比妥鈉麻醉SD大鼠后、切開(kāi)皮膚、鈍性分離暴露生物仿生骨組織后取出組織，實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)橢圓形骨組織生成，組織質(zhì)地較硬，形態(tài)規(guī)整。HE染色、ALP染色、茜素