親骨性BMP-2活性多肽及其仿生骨修復(fù)材料生物活性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分兩種不同BMP2活性多肽的親骨性評(píng)價(jià)
　　目的：對(duì)比研究兩種不同BMP-2活性多肽的親骨性,以探討影響多肽親骨性的相關(guān)因素。
　　方法：以固相合成法分別合成兩種不同的BMP-2活性多肽P20和P24,在P24中增加設(shè)計(jì)聚天冬氨酸短肽和磷酸化絲氨酸活性位點(diǎn)。以納米羥基磷灰石晶體模擬骨組織,采用經(jīng)典的吸附法對(duì)兩種多肽進(jìn)行初步的體外骨吸附性能研究,分別在不同吸附時(shí)間和不同質(zhì)量羥基磷灰石介質(zhì)的條件下考察兩種多肽對(duì)羥基磷灰石的

2、吸附率。
　　結(jié)果：兩種BMP-2活性多肽在30min內(nèi)均能與羥基磷灰石迅速吸附,此后隨時(shí)間延長吸附速度減緩,P20在60min時(shí)吸附率達(dá)到峰值,而P24在90min時(shí)達(dá)到峰值,為P20的兩倍。兩種多肽的吸附率隨著羥基磷灰石質(zhì)量的增多而升高,在5mg、10mg和15mg三種不同羥基磷灰石量時(shí)P24的吸附率均顯著高于P20(P<0.05),P24對(duì)15mg羥基磷灰石的吸附率幾乎是同樣條件下P20的3倍。
　　結(jié)論：通過加入聚天

3、冬氨酸和磷酸化絲氨酸活性位點(diǎn)可顯著增強(qiáng)BMP-2活性多肽的親骨性,P24具有良好的親骨性。親骨性BMP-2活性多肽對(duì)羥基磷灰石的最佳吸附時(shí)間是90min,且其吸附率與羥基磷灰石質(zhì)量呈正相關(guān)。
　　第二部分?jǐn)y載不同BMP2活性多肽的仿生骨基質(zhì)材料體外控釋及其對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞粘附、增殖及成骨分化能力的影響
　　目的：觀察兩種BMP-2活性多肽的體外釋放動(dòng)力學(xué),評(píng)價(jià)不同多肽和仿生骨基質(zhì)材料對(duì)小鼠MC3T3-E1前成骨細(xì)胞粘附

4、、增殖和成骨分化能力的影響。
　　方法：將兩種不同的BMP-2活性多肽P20和P24分別與TBC和nHAC/PLA兩種載體材料復(fù)合,構(gòu)建P20/TBC、P20/nHAC/PLA、P24/TBC和P24/nHAC/PLA仿生骨基質(zhì)材料,同時(shí)以P24/可吸收膠原蛋白海綿緩釋體為對(duì)照比較BMP-2活性多肽在各種支架材料中的釋放動(dòng)力學(xué)。為評(píng)價(jià)各仿生骨基質(zhì)材料的生物學(xué)活性,將實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照、P20和P24三組,每組另設(shè)TBC和nHAC/P

5、LA兩個(gè)亞組。分別將小鼠MC3T3-E1前成骨細(xì)胞種植在各組材料表面,分別測(cè)定細(xì)胞在材料表面的粘附率,采用MTT法檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞在材料上的增殖活性,通過檢測(cè)堿性磷酸酶(ALP)活性來評(píng)價(jià)MC3T3-E1細(xì)胞在各組材料上的成骨分化活性。
　　結(jié)果：體外控釋實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)P24和P20無論在nHAC/PLA還是TBC材料中,均較P24在ACS材料中釋放更加緩慢,同時(shí)P24較P20在兩種材料中的緩釋效果更突出。而細(xì)胞粘附率、MTT實(shí)

6、驗(yàn)及ALP活性檢測(cè)結(jié)果顯示,MC3T3-E1細(xì)胞在所有多肽組仿生骨基質(zhì)材料表面的粘附和增殖能力及ALP活性均顯著高于空白組,而在P24組顯著高于P20組,在P24/TBC組顯著高于P24/nHAC/PLA組,組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：TBC和nHAC/PLA均適合作為BMP-2活性多肽的緩釋載體材料,且TBC尤為理想。親骨性可明顯增強(qiáng)P24在TBC和nHAC/PLA材料中的緩釋性能,并能明顯促進(jìn)小鼠MC3

7、T3-E1前成骨細(xì)胞在材料上的粘附、增殖和成骨分化。
　　第三部分不同BMP2活性多肽/仿生骨基質(zhì)材料復(fù)合物體內(nèi)誘導(dǎo)異位成骨的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：比較P20和P24與TBC和nHAC/PLA構(gòu)建的仿生骨基質(zhì)材料的異位成骨能力,探討親骨性對(duì)多肽骨誘導(dǎo)活性的影響。
　　方法：將30只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、P20組及P24組,每組下設(shè)煅燒骨和nHAC/PLA兩個(gè)亞組。每只大鼠制備雙側(cè)股四頭肌肌袋模型,按實(shí)驗(yàn)分組分別于左側(cè)放

8、入TBC材料,右側(cè)放入nHAC/PLA材料。植入材料后第2、8周分別做放射學(xué)檢測(cè)(X-ray、3D-CT)并記錄植入體CT骨密度值(HU)。術(shù)后2、8周分別處死大鼠取材,應(yīng)用高分辨率MicroCT測(cè)定標(biāo)本內(nèi)羥基磷灰石總體積值(BV),然后標(biāo)本行HE染色組織學(xué)檢測(cè)。
　　結(jié)果：8周時(shí)X線檢測(cè)可見P24組植入體密度均較2周時(shí)增高,P20及空白組密度變化不明顯。CT掃描骨密度檢測(cè)結(jié)果顯示,8W時(shí)P20/TBC組、P24/TBC組植入體骨

9、密度值較2W時(shí)明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而空白組、P20/nHAC/PLA組和P24/nHAC/PLA組植入體骨密度值較2W時(shí)僅略增高,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。BV定量結(jié)果顯示:在TBC組,2W和8W時(shí)P24組BV值均顯著高于其他各組,P20組僅8W時(shí)顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。nHAC/PLA組在2W時(shí)各組間無顯著性差異(P>0.05),8W時(shí)P24組BV值顯著高于其他各組,P20組顯

10、著高于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組織形態(tài)學(xué)觀察2周時(shí)P24/TBC組植入體孔隙內(nèi)可看到散在的類骨質(zhì)形成。8周時(shí)P24/TBC組可見大量編織骨形成、有較多活躍的成骨細(xì)胞及新生血管結(jié)構(gòu)。P24/nHAC/PLA組新生骨組織明顯少于P24/TBC組。P20組僅見散在類骨質(zhì)形成?？瞻捉M無明顯成骨。
　　結(jié)論：煅燒骨和nHAC/PLA均是理想的骨組織工程支架材料,增加親骨性后能顯著增強(qiáng)BMP-2活性多肽與兩種材料復(fù)合構(gòu)建的仿

11、生骨基質(zhì)材料的異位成骨能力
　　第四部分親骨性BMP2活性多肽/煅燒骨復(fù)合支架材料修復(fù)犬橈骨臨界性缺損的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：觀察親骨性BMP-2活性多肽P24/煅燒骨復(fù)合材料修復(fù)犬橈骨臨界性骨缺損的能力,探討其進(jìn)一步應(yīng)用的可行性。
　　方法：6只比格犬制備雙側(cè)橈骨中段20mm臨界性骨缺損,按側(cè)別隨機(jī)分為4組,空白對(duì)照組骨缺損處不放置任何植入物,TBC組植入單純TBC材料,P24組植入P24/TBC復(fù)合材料,BMP2組植

12、入rhBMP2/TBC復(fù)合材料。術(shù)后12周和24周分別行X線檢測(cè),術(shù)后24周取材行CT掃描加三維重建并行組織學(xué)檢測(cè)評(píng)價(jià)各組材料的骨修復(fù)能力。
　　結(jié)果：影像學(xué)及組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果均提示空白對(duì)照組骨缺損處無新骨形成;TBC組各時(shí)間點(diǎn)影像學(xué)檢查均無明顯骨痂形成,骨-材料界面無明顯融合,組織學(xué)觀察可見缺損內(nèi)少許類骨質(zhì)和編織骨形成,無板層骨結(jié)構(gòu);P24組在12W時(shí)骨-材料界面模糊,有少許骨痂形成,24W時(shí)較多骨痂形成,骨-材料界面已融為一體。