淀粉樣蛋白結(jié)合醇脫氫酶(ABAD)基因缺陷對(duì)小鼠腦及SK細(xì)胞線粒體功能的影響.pdf

1、阿爾茨海默病(AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，以進(jìn)行性多項(xiàng)認(rèn)知損害為主要表現(xiàn)的綜合征?；颊吣X中三大病理特征為淀粉樣蛋白(Aβ)沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)及神經(jīng)元丟失。近年來(lái)細(xì)胞內(nèi)Aβ、線粒體功能紊亂在AD發(fā)病中的作用已成為研究熱點(diǎn)。
　　 淀粉樣蛋白結(jié)合醇脫氫酶(ABAD)位于線粒體基質(zhì)，催化醛、酮、醇及類固醇等的氧化或還原。Aβ存在時(shí)，Aβ可與ABAD結(jié)合，使后者構(gòu)象改變，引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激可致細(xì)胞死亡。而無(wú)Aβ環(huán)境下，ABAD在應(yīng)激情

2、況下對(duì)機(jī)體有保護(hù)作用。
　　 為更好研究ABAD與Aβ結(jié)合后在AD發(fā)病中的作用及ABAD本身的生理作用，建立ABAD基因敲除小鼠模型是一研究基礎(chǔ)。目前已成功新建立神經(jīng)元內(nèi)選擇性ABAD基因敲除小鼠模型。本實(shí)驗(yàn)對(duì)該小鼠一般性狀、特征，及線粒體功能，且對(duì)于引起人類MHBDD疾病的ABAD三個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行了初步的研究，為ABAD在線粒體內(nèi)的功能提供一些線索。
　　 第一部分選擇性ABAD基因敲除對(duì)小鼠神經(jīng)細(xì)胞及其線粒體功能影響

3、的初步研究
　　 目的：選擇性神經(jīng)元內(nèi)ABAD基因敲除小鼠(ABAD ko小鼠)是新建立的小鼠模型，需要明確其基本特征及神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能。探索神經(jīng)元內(nèi)ABAD表達(dá)量下降導(dǎo)致線粒體功能紊亂的可能原因。
　　 方法：使用CREB PCR及FLOX MR鑒定ABAD ko小鼠基因型。使用westernblot及免疫熒光染色鑒定ABAD在其大腦皮層及海馬表達(dá)量。TMRM熒光染色了解線粒體膜電位變化，MitoSOX熒光染色觀察線

4、粒體氧自由基的釋放，用ATP試劑盒測(cè)定腦組織ATP含量，TUNEL試劑盒染色觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。免疫熒光染色及Western blot觀察MHB、CypD及其它多種蛋白表達(dá)量的改變。用ImageJ對(duì)Western blot條帶及熒光染色進(jìn)行量化，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算ATP腦組織含量，對(duì)TUNEL陽(yáng)性的細(xì)胞及神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)等，用student t test比較基因敲除小鼠與對(duì)照小鼠的差異。
　　 結(jié)果：ABAD ko小鼠基因型為CR

5、EB(+)且FLOXΔAneo。Western Blot結(jié)果提示ABAD ko小鼠皮層及海馬ABAD的表達(dá)量明顯下降，密度值分別為皮層0.81±0.129 vs.0.29±0.031，P=0.00098，海馬1.74±0.144 vs.1.00±0.160，P=0.01894。免疫熒光染色提示ABAD ko小鼠上述部位ABAD表達(dá)量下降。MHB染色發(fā)現(xiàn)ABAD ko小鼠皮層MHB較wt小鼠明顯增多，密度值為11.14±0.609 vs。

6、6.92±0.354，P=0.018，海馬中ABAD ko小鼠MHB密度值較wt小鼠高，但P=0.48，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ABAD ko小鼠內(nèi)嗅皮層中TMRM染色明顯減低(1.00±0.081 vs。0.75±0.049，P=0.036)，運(yùn)動(dòng)感覺(jué)皮層無(wú)明顯降低(P=0.754)。MitoSOX染色在ABAD ko小鼠內(nèi)嗅皮層中明顯升高(1.00±0.062 vs.1.37±0.085，P=0.004)，而在運(yùn)動(dòng)感覺(jué)皮層無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0

7、.336)。腦組織ATP含量測(cè)定ABAD ko小鼠數(shù)值相對(duì)低，但兩組小鼠無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能取腦時(shí)間及部位不同影響結(jié)果(wt小鼠腦ATP含量2.54±0.282，ABAD ko小鼠ATP含量2.11±0.210，P=0.264)。TUNEL染色發(fā)現(xiàn)7-8月ABAD ko小鼠皮層及海馬均有TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，較對(duì)照組明顯升高，且內(nèi)嗅皮層區(qū)神經(jīng)元與總神經(jīng)細(xì)胞比值明顯下降，提示有神經(jīng)元丟失(ABAD ko小鼠內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元與總細(xì)胞比值0.298

8、±0.069，wt小鼠0.67±0.050，P=0.032)，而3-5個(gè)月的ABAD ko及wt小鼠大腦皮層或海馬中均無(wú)TUNEL陽(yáng)性染色，且皮層運(yùn)動(dòng)感覺(jué)區(qū)及內(nèi)嗅皮層均無(wú)明顯神經(jīng)元丟失。另外Westernblot結(jié)果發(fā)現(xiàn)CypD、nrf2、SODII、GFAP在ABAD ko小鼠腦組織中明顯升高，COXIV、PSD95、Synaptophysin等表達(dá)量明顯下降。
　　 結(jié)論：ABAD ko小鼠的基因型為CREB(+)且FLOX

9、△neo，皮層及海馬神經(jīng)元中ABAD表達(dá)量明顯降低，其底物MHB在上述部位堆積，為導(dǎo)致下游膜電位下降，ROS增多及細(xì)胞凋亡的原因之一。ABAD ko小鼠腦中CypD表達(dá)量升高，可能為導(dǎo)致線粒體功能紊亂的另一原因。ABAD ko小鼠大腦皮層中內(nèi)嗅皮層損傷嚴(yán)重。GFAP，SoDII，Nrf2表達(dá)量上升，可能與星形膠質(zhì)細(xì)胞增生對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激有關(guān)，PSD95、Synaptophysin表達(dá)量降低，提示突觸功能受影響。
　　 第二部分

10、 ABAD及三種突變體對(duì)氧化應(yīng)激損害反應(yīng)的研究
　　 目的：人類疾病MHBDD是由ABAD基因某些位點(diǎn)的點(diǎn)突變引起。既往認(rèn)為是突變?cè)斐葾BAD對(duì)MHB酶活性下降導(dǎo)致MHB在腦內(nèi)堆積引起發(fā)病，而最近有報(bào)道認(rèn)為還有其它途徑損傷線粒體。因此，本研究建立空載體轉(zhuǎn)染、wtABAD轉(zhuǎn)染及三個(gè)mutABAD轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定細(xì)胞系，觀察wtABAD及三種突變體對(duì)氧化應(yīng)激損害的反應(yīng)，研究ABAD突變引起線粒體功能紊亂的可能途徑。
　　 方法：建

11、立穩(wěn)定表達(dá)的空載體，wtABAD，三個(gè)mutABAD(R130C，D86G，Q165H)的SK-N-SH細(xì)胞系。用Western blot檢驗(yàn)ABAD表達(dá)量，AEC染色鑒定細(xì)胞形態(tài)及純度。選出合適的克隆后，加入H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，用MTT試劑盒、ATP試劑盒，測(cè)定各個(gè)細(xì)胞系中細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)及細(xì)胞內(nèi)ATP含量的變化。兩組間MTT數(shù)值及ATP含量差異用student t test檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：wtABAD組與空載體轉(zhuǎn)染的對(duì)

12、照相比，H2O2處理24小時(shí)濃度為25uM，50uM，100uM組及處理48小時(shí)濃度為25uM，50uM組，MTT值明顯升高(P<0.05)。wtABAD轉(zhuǎn)染的ABAD表達(dá)量不同的克隆里，對(duì)氧化應(yīng)激均具有明顯保護(hù)作用，且ABAD表達(dá)量低，保護(hù)作用相對(duì)好，H2O2濃度高時(shí)保護(hù)作用更明顯。mutABAD組里，100uM H2O2處理細(xì)胞24小時(shí)后MTT發(fā)現(xiàn)，R130C及Q165G組MTT值與對(duì)照相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(R130C：0.80±0

13、.033 vs.0.73±0.059，P=0.340；Q165H：0.80±0.033 vs.0.89±0.050，P=0.162)，D86G組數(shù)值明顯下降(0.80±0.033 vs。0.48±0.011，P=0.011)。250uM H2O2處理細(xì)胞24小時(shí)后MTT發(fā)現(xiàn)，D86G、R130C數(shù)值明顯下降(D86G：0.50±0.076 vs.0.08±0.002，P=0.001；R130C：0.50±0.076 vs.0.15±0.

14、021，P=0.001)，Q165H數(shù)值上升(0.50±0.076 vs.0.69±0.019，P=0.030)。
　　 ATP結(jié)果提示H2O2100uM，200uM處理24小時(shí)后，對(duì)照組ATP含量較wtABAD組明顯降低(100uM：0.90±0.086 vs.1.18±0.079，P=0.036:200uM：0.66±0.071 vs.1.07±0.092，P=0.006)。50uM H2O2處理，wtABAD至48小時(shí)AT

15、P含量無(wú)明顯下降，而對(duì)照組ATP含量明顯下降(24hr：1.01±0.066 vs.0.95±0.081，P=0.391；48hr：0.83±0.032 vs.1.05±0.071，P=0.036)。而三個(gè)mutABAO組，100uM及200uM H2O2處理細(xì)胞24小時(shí)后測(cè)定ATP發(fā)現(xiàn)，ATP值與對(duì)照相比均無(wú)明顯升高。
　　 結(jié)論：H2O2引起的氧化應(yīng)激情況下，wtABAD轉(zhuǎn)染SK細(xì)胞克隆對(duì)細(xì)胞均有保護(hù)作用，而三種mutABA