乳腺癌中線粒體DNA D-loop區(qū)突變的研究.pdf

1、目的： 線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)缺乏組蛋白的保護，其損傷修復系統(tǒng)也不完善，mtDNA所在的位置與線粒體內(nèi)ROS產(chǎn)生的位點相接近，故mtDNA極易在多種損傷因子的作用下發(fā)生突變，尤以D-loop區(qū)的突變率最高。目前已經(jīng)在包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了mtDNA突變[14]，并推測mtDNA的突變在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起作用。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，我國雖屬乳腺癌低發(fā)國家，但近年來其發(fā)

2、病率亦有明顯上升趨勢，已經(jīng)成為嚴重威脅我國女性健康的主要疾病之一。本研究中我們通過對乳腺癌中D-loop區(qū)突變情況的分析，對mtDNA D310的微衛(wèi)星不穩(wěn)定的分析，以及對16189位點多態(tài)性的分析，進而闡述mtDNA D-loop區(qū)的突變與乳腺癌間的關系。 方法： 收集乳腺癌(breast cancer，下文以BC表示)病例72例，良性乳腺疾病(benign breast disease，下文以BBD表示)病例56例，

3、以及可以排除乳腺腫瘤等婦科腫瘤，排除常見的與線粒體有關的疾病的正常對照(normal control，下文以NC表示)標本。利用PCR擴增、產(chǎn)物純化和直接測序等技術，通過患者自身外周血與灶區(qū)組織對照來確定是否突變，結合臨床資料，以72例BC患者為實驗組，56例BBD患者為對照組，對兩組病人的D-loop區(qū)突變情況進行分析，以分析癌癥患者與良性乳腺疾病間的突變是否有差別。此外，我們還建立了涵蓋116例正常人血液標本D-loop區(qū)序列的健康

4、對照基因庫，將患病組和健康人群的mtDNA D310區(qū)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)和16189位點的多態(tài)性進行比較分析。 結果： 1.在所測得的72例BC標本mtDNA D-loop區(qū)序列中，61例未發(fā)現(xiàn)突變，11例標本發(fā)現(xiàn)突變，突變比例為15.3％，突變位點數(shù)為13個，突變位點集中位于HVRⅠ(7/13)和HVRⅡ(5/13)。在所測得的56例BBD標本mtDNA D-

5、loop區(qū)序列中，43例未發(fā)現(xiàn)突變，13例標本發(fā)現(xiàn)突變，突變比例為23.2％，突變位點數(shù)為17個，突變集中位于HVRⅠ(3/17)和HVRⅡ(10/17)。其中9個突變位點于位于MT-OHR(nt110-441)，7個位于7S DNA(nt16106-191)，1個位于線粒體轉錄因子(mitochondrial transcription factor1，mtTF1)結合位點，3個位于D-loop區(qū)的其它區(qū)段。BC組與BBD組的突變比例

6、非常接近，二者無統(tǒng)計學差異。 2.將D-loop區(qū)突變情況與BC患者、BBD患者的年齡、腫塊大小、ER水平、是否轉移等因素的關系進行統(tǒng)計學分析，發(fā)現(xiàn)突變的分布情況在癌細胞發(fā)生轉移和未發(fā)生轉移兩組間存在顯著差異。22例癌轉移的乳腺癌病人中均無D-loop區(qū)的突變，47例未發(fā)生癌轉移的乳腺癌病人中有11例存在D-loop區(qū)的突變，p值為0.014(<0.05)。 3.我們對72例BC病例，56例BBD病例，及116例NC的血

7、液標本進行16189位點的多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)BBD組中84％的乳腺纖維腺瘤患者為16189 T，BC組中62.5％的患者為16189 T，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)兩組間具有顯著性差異，p值為0.047。其余組間兩兩比較均無顯著差異。 4.對所有標本的D310區(qū)進行MSI分析顯示，BC組中55.5％(40/72)的病人存在MSI，BBD組中71.4％(40/56)的病人存在MSI，NC組中66.4％(77/116)的病人存在MSI。BC組中D3

8、10區(qū)的MSI較其余兩組明顯偏低。 結論： 1.乳腺癌轉移組中無一例病例存在D-loop區(qū)的突變，乳腺癌未轉移組中23.4％(11/47)的病例出現(xiàn)D-loop區(qū)的突變。其中，未轉移組的突變位點集中位于兩個高變區(qū)(10/11)，其中5例位于HVRⅡ，5例位于HVRⅠ。雖然我們的研究數(shù)據(jù)顯示D-loop區(qū)的突變與乳腺癌是否發(fā)生轉移之間的關系在統(tǒng)計學上具有統(tǒng)計意義(經(jīng)卡方檢驗p值為0.014<0.05)。但是，查閱文獻尚未見

9、有相關報道。因此，在此尚無法下結論，仍需大量的實驗數(shù)據(jù)支持，以及進一步的研究。 2.BF組的16189T分布比例明顯高于其他組，提示，16189位點變異為T或可能有更高的乳腺纖維腺瘤發(fā)病風險？同時，在BC和NC組間該位點的多態(tài)性分布情況非常接近，顯示該位點的多態(tài)性與乳腺癌間沒有顯著相關性。 3.對各組標本的D310區(qū)MSI分析結果顯示，各組的MSI比例接近，無統(tǒng)計學差異。但仍能發(fā)現(xiàn)BC組中D310區(qū)的MSI比例較其余兩組