CRMP-1在JEG-3細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及浸潤中的作用.pdf

1、目的:滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤在正常的胎盤發(fā)生過程中非常重要。有研究人坍塌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(CRMP-1)在癌細(xì)胞浸潤及遷移的過程中起著重要的作用。但是CRMP-1在滋養(yǎng)細(xì)胞中的生物學(xué)作用如增殖、凋亡、遷移、浸潤作用仍沒有人報(bào)道。研究主要致力于構(gòu)建CRMP-1真核表達(dá)載體，并通過過表達(dá)CRMP-1來研究CRMP-1在體外對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞JEG-3的增殖、凋亡、浸潤及遷移作用。
　　 材料與方法:
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 細(xì)胞株來

2、源及培養(yǎng)：人類絨毛膜癌細(xì)胞系JEG-3細(xì)胞株購自中科院細(xì)胞所，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院傳染科實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM/F12+10％FBS+100IU/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素，在潮濕的37℃，含5％CO2的空氣中培養(yǎng)。
　　 主要試劑：CRMP-1兔抗人單克隆抗體（Abcam公司）；羊抗兔二抗、兔抗人β-actin抗體（北京中杉金橋生物有限公司）；PBS（自行配置）；LB培養(yǎng)基、氨芐青霉素(ampicil

3、lin)（100mg/ml）、卡那霉素（kanamycin）（10mg/ml）（自行配置）；Western blot相關(guān)試劑：30％丙烯酞胺/N，N，-亞甲雙丙烯酞胺(30％AcryBis)、l.Omol/L Tris-HCl(PH=6.8)、1.5M Tris-HCI(pH8.8)、10％SDS、10％過硫酸胺(10％APS)、2 xSDS上樣緩沖液(Loading Buffer)、轉(zhuǎn)移緩沖液、5XTris甘氨酸電泳緩沖液、TBS-T

4、溶液均自行配置；免疫組化試劑盒，包括3％過氧化氫、封閉液、生物素標(biāo)記的二抗及S-P復(fù)合物（北京中杉金橋生物有限公司）；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑（北京中杉金橋生物有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（申能博彩生物有限公司）；CCK-8 DOJINDO公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（碧云天公司）；Lipofectamine2000（invitrogen公司）；Matrigel膠（美國BD公司）；Traswell（cor

5、ning公司）。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 方法：①細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)；②構(gòu)建真核表達(dá)載體；③轉(zhuǎn)染用脂質(zhì)體Lip2000轉(zhuǎn)染法，根據(jù)說明書進(jìn)行；④過表達(dá)CRMP-1;⑤蛋白印記(Westernblot);⑥免疫細(xì)胞化學(xué)；⑦增殖實(shí)驗(yàn)(CCK-8);⑧流式細(xì)胞術(shù)；⑨遷移實(shí)驗(yàn)；⑩Matirgel體外浸澗實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)果判斷及分析：①構(gòu)建真核表達(dá)載體根據(jù)測(cè)序圖及測(cè)序結(jié)果跟模板序列對(duì)比，可鑒定構(gòu)建目的基因的準(zhǔn)確率；②Wes

6、tern-b lot結(jié)果掃描后經(jīng)Gel-proAnalysis圖像分析軟件進(jìn)行圖像灰度值分析；③免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果陽性細(xì)胞為胞漿著色呈黃色。根據(jù)黃色顆粒沉著的部位判定CRMP-1轉(zhuǎn)染JEG-3后在細(xì)胞中的分布；④增殖實(shí)驗(yàn)根據(jù)空白細(xì)胞組、空質(zhì)粒組及目的基因組三組450nmOD值繪制細(xì)胞增殖曲線，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，觀察CRMP-1過表達(dá)對(duì)JEG-3細(xì)胞增殖的影響；⑤凋亡圖中所示凋亡早期及凋亡晚期細(xì)胞所占的比例，可初步判斷目的基因?qū)EG-3細(xì)胞

7、凋亡的影響；⑥遷移實(shí)驗(yàn)根據(jù)劃痕的面積判斷過表達(dá)CRMP-1對(duì)JEG-3細(xì)胞劃痕愈合的程度；⑦浸潤實(shí)驗(yàn)在每個(gè)小室在400倍光鏡下計(jì)數(shù)膜背面穿過細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)中間和周圍五個(gè)視野，取平均值。
　　 數(shù)據(jù)分析：使用SPSS16.0軟件，單因素方差分析(One-way Anova)。數(shù)據(jù)用x±s形式。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 一、成功構(gòu)建CRMP-1真核表達(dá)載體酶切鑒定和基因序列測(cè)定,均證實(shí)重

8、組質(zhì)粒CRMP-1-p3x-FLAG-myc-CMV-24構(gòu)建正確。
　　 二、過表達(dá)CRMP-1對(duì)JEG-3細(xì)胞產(chǎn)生抑制增殖、浸潤及遷移，促進(jìn)凋亡的作用Western blot結(jié)果證明成功將目的基因轉(zhuǎn)入JEG-3細(xì)胞系，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果證明CRMP-1分布在JEG-3胞質(zhì)中，過表達(dá)CRMP-1對(duì)JEG-3細(xì)胞增殖的影響在轉(zhuǎn)染后48h有明顯抑制作用；凋亡實(shí)驗(yàn)在48h對(duì)早期細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用，對(duì)晚期細(xì)胞凋亡無明顯促進(jìn)或抑制作用；轉(zhuǎn)