雷帕霉素對絨癌JEG-3細胞株的影響及其機制初探.pdf

1、的:
　　 用雷帕霉素對人絨癌細胞株JEG-3進行處理,探討其對JEG-3的作用。分別采用MTT法、流式細胞術(shù)、Transwell技術(shù)檢測雷帕霉素處理前后JEG-3細胞在增殖、凋亡和侵襲能力的改變,為臨床治療絨癌打下體外實驗的基礎(chǔ)。
　　 運用RT-PCR,Western-blot檢測雷帕霉素對其靶點mTOR的RNA和蛋白表達量的影響;用Western-blot檢測雷帕霉素處理前后mTOR及調(diào)控的下游蛋白P-4EBP1和

2、 P-p70S6K的蛋白表達量的變化。初步探討引起增殖、凋亡和侵襲能力的改變的分子機制。
　　 方法:
　　 1.細胞培養(yǎng)。
　　 2.實驗分組:第1組為對照組細胞不加任何藥物處理；第2組為加0.01％的DMSO；第3、4、5、6組加雷帕霉素處理組,藥物濃度依次為0.1,1,10,100ng/ml。
　　 3.MTT法:用于檢測不同實驗組細胞增殖情況。
　　 4.流式細胞檢測技術(shù):用于檢測不同實驗

3、組細胞凋亡情況。
　　 5.Transwell實驗:檢測不同實驗組的細胞侵襲能力。
　　 6.RT-PCR:檢測不同實驗組mTOR mRNA表達量。
　　 7.Western Blot:檢測不同實驗組mTOR、P-4EBP1和P-p70S6K蛋白表達量。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT法檢測結(jié)果
　　 結(jié)果顯示雷帕霉素對JEG-3的增殖有抑制作用(F=8.46,P<0.05),濃度0.1,

4、1,10ng/ml組,隨著濃度的增加抑制越明顯,而10ng/ml和100ng/ml處理組無差異。對照組加0.1％DMSO和未加任何藥物處理的細胞吸光度無差異(P>0.05)。
　　 2.流式技術(shù)檢測細胞凋亡的結(jié)果
　　 0.1,1,10ng/ml處理組隨濃度梯度的增加凋亡率增加(F=7.29,P<0.05),10ng/ml和100ng/ml處理組無差異。通過Dunnett組間比較發(fā)現(xiàn)對照組和加DMSO組之間無顯著差異(P

5、=0.083)。
　　 3.Transwell侵襲實驗結(jié)果
　　 結(jié)果顯示100ng/ml處理組絨癌細胞侵襲能力下降,明顯低于對照組(F=4.24,P<0.05)；對照組和DMSO組無顯著差異(P>0.05)。
　　 4.mTOR的RT-PCR和Western結(jié)果
　　 100ng/ml雷帕霉素處理的mTOR RNA量和蛋白表達與對照組相比沒有明顯變化。
　　 5.P-4EBP1,P-p70S6K

6、的Western blot結(jié)果
　　 藥物處理組隨濃度的增加P-4EBP1,P-p70S6K均有明顯下降。將3、4、5、6組分別與對照組組兩兩比較均有顯著差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究通過MTT實驗、流式細胞技術(shù)和Transwell實驗發(fā)現(xiàn)雷帕霉素處理組與對照組相比,細胞增殖明顯降低、細胞凋亡明顯增加和侵襲能力明顯減弱。
　　 2.在MTT實驗和流式細胞技術(shù)檢測中還發(fā)現(xiàn),雷帕霉素濃

7、度都在0.1-10ng/ml之間隨著濃度的增加抑制率和凋亡率都增加,而10ng/ml和100ng/ml濃度相比較抑制率和凋亡率差異不顯著。說明10ng/ml的雷帕霉素對絨癌JEG-3的影響達到了最大效應(yīng),即雷帕霉素對于絨癌細胞株的影響具有劑量依耐性。
　　 3.通過RT-PCR和Western blot實驗,發(fā)現(xiàn)mTOR的RNA總量和蛋白量隨藥物濃度梯度的增加變化不明顯,說明雷帕霉素并不直接作用于mTOR的RNA和蛋白表達水平,