國產(chǎn)雷帕霉素對人淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞增殖影響的機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討國產(chǎn)雷帕霉素(宜欣可)對人淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞的體外抗增殖作用及對細(xì)胞周期的影響，并探討其分子機(jī)制。 方法：常規(guī)體外培養(yǎng)人淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(tetrzolium-based colorimetric assay,MTT)法檢測國產(chǎn)雷帕霉素不同濃度組(0、1、5、10、20、40、50、100nmol/ml)、不同時間組(24、48、72h)細(xì)胞存活和生長的情況，從而選擇適當(dāng)?shù)乃幬餄舛燃白?/p>

2、用時間點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的檢測。根據(jù)上述MTT結(jié)果，篩選不同濃度的實(shí)驗(yàn)組(5、10、20、40、50、100nmol/ml)分別與陽性對照組比較；篩選不同時間(24、48h)的實(shí)驗(yàn)組與12小時實(shí)驗(yàn)組(MTT試驗(yàn)抑制增殖不明顯)及各自相應(yīng)的陽性對照組比較，并用流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)測定各組國產(chǎn)雷帕霉素對Raji細(xì)胞周期分布和凋亡的影響，然后提取經(jīng)國產(chǎn)雷帕霉素50nmol/ml作用不同時間(0、12、24、48、72h

3、)的細(xì)胞總蛋白，考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線法(Bradford法)定量，以β-actin作為內(nèi)參照，應(yīng)用western blot方法檢測不同組別周期蛋白cyclinD1、cyclinE、cyclinA、p27及凋亡蛋白抑制因子survivin蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.MTT結(jié)果：國產(chǎn)雷帕霉素對Raji細(xì)胞具有抑制增殖的作用。不同濃度國產(chǎn)雷帕霉素(1、5、10、20、40、50、100nmol/ml)處理細(xì)胞24、48、72小

4、時后，與對照組相比各處理組吸光度值(OD)均有不同程度的下降，經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)后顯示，國產(chǎn)雷帕霉素處理24小時后藥物濃度為1nmol/ml和5nmol/ml的處理組與相應(yīng)對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；藥物處理48小時和72小時后濃度為1nmol/ml的處理組與相應(yīng)的對照組比較也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各不同濃度、不同時間點(diǎn)的藥物處理組與相應(yīng)的對照組之間具有顯著性差異(P＜0.05)。且隨著國產(chǎn)雷帕霉素處理濃度的增大、作用時間的延長、OD值

5、逐漸下降，即國產(chǎn)雷帕霉素對Raji細(xì)胞的增殖抑制作用有明顯的劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)依賴關(guān)系。 2細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測：流式細(xì)胞儀檢測國產(chǎn)雷帕霉素處理后的Raji細(xì)胞周期分布和凋亡情況顯示，不同濃度不同時間點(diǎn)國產(chǎn)雷帕霉素處理后的Raji細(xì)胞均未見到明顯的亞二倍體凋亡峰。但隨著藥物濃度的加大、藥物作用時間的延長，處于G0/G1期的細(xì)胞逐漸增多，而處于S期和G2/M期的細(xì)胞則逐漸減少。即國產(chǎn)雷帕霉素處理后的Raji細(xì)胞沒有明顯的凋亡，而細(xì)胞

6、周期進(jìn)程阻滯于G0/G1期，且該作用呈明顯的劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)依賴關(guān)系。 3.Western blot檢測結(jié)果：國產(chǎn)雷帕霉素50nmol/L處理后cyclinD1、cyclinE、p27的表達(dá)沒有明顯變化。在國產(chǎn)雷帕霉素處理后不能檢測到cyclinA和survivin蛋白的表達(dá)。 結(jié)論： 1國產(chǎn)雷帕霉素(宜欣可)通過阻滯Raji細(xì)胞周期于G0/G1期而抑制Raji細(xì)胞的生長、增殖，其機(jī)制與下調(diào)cyclinA和