大鼠背根神經節(jié)膜聯蛋白A2和β5微管蛋白真核表達載體的構建及表達.pdf

1、研究背景：
　　 神經病理性疼痛是神經系統(tǒng)損傷引起的一種慢性狀態(tài)，嚴重困擾人類的健康。背根神經節(jié)(dorsal root ganglia， DRG)作為痛覺傳入的第一級神經元，在神經病理性疼痛的外周機制中起著重要作用。目前有研究表明細胞骨架及其相關蛋白如膜聯蛋白A2（annexinⅡ，annexin A2）和β5微管蛋白(tubulin beta-5/beta5-tubulin)與DRG傷害性感受傳導過程關系密切，但分子機制尚不

2、明確。本實驗利用基因工程的技術，提取大鼠DRG中annexinⅡ的基因Anxa2和tubulin beta-5的基因Tubb5，構建其真核表達載體，并對其在哺乳動物細胞中的表達作初步鑒定，以期為深入研究annexinⅡ和tubulin beta-5在調控DRG傷害性感受傳導過程中的分子機制及明確與其相互作用的蛋白奠定基礎。
　　 研究目的：
　　 克隆大鼠背根神經節(jié)annexinⅡ和tubulin beta-5的基因，構

3、建真核表達載體并檢測其表達。
　　 研究方法：
　　 提取大鼠腰部背根神經節(jié)組織總RNA，RT-PCR法擴增大鼠DRG細胞中annexinⅡ的基因Anxa2和tubulin beta-5的基因Tubb5，分別構建pGMT-Anxa2和 pGMT-Tubb5克隆載體。以此為模板，設計含有flag標簽序列的引物序列，上下游分別插入HindⅢ、NotⅠ酶切位點，PCR擴增Anxa2-flag和Tubb5-flag序列，并與pc

4、DNA3.1(+)空載體行連接轉化Top10感受態(tài)細胞，在Amp瓊脂平板上挑選克隆。抽提質粒后行PCR及酶切鑒定，鑒定為陽性克隆者用T7、BGH引物對其進行全序列測定分析。從而獲得表達載體pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag和pcDNA3.1(+)-Tubb5-flag。采用Lipo2000脂質體法將表達載體轉染到六孔板培養(yǎng)的HEK293細胞中，設表達載體組、pcDNA3.1(+)空載體對照組和空轉HEK293細胞的陰性對照組。

5、細胞免疫熒光檢測需事先制成細胞爬片，轉染48小時后分別以小鼠源性anti-flag抗體(1:200)、FITC標記的山羊抗小鼠IgG(1:200)孵育，DAPI染核、封片后于倒置熒光顯微鏡下觀察結果并照相。FITC激發(fā)后可產生綠色熒光，指示目的蛋白annexinⅡ或tubulin beta-5的分布；DAPI激發(fā)后可產生藍色熒光，指示細胞核的分布。六孔板（未置爬片）細胞轉染48-72小時后，收集細胞提取蛋白。以小鼠源性anti-flag

6、抗體為一抗(1:500)、辣根過氧化物標記的IgG-HRP為二抗(1:5000)行Western blot法檢測。
　　 結果：
　　 1．PCR擴增Anxa2/Tubb5的mRNA編碼序列：Anxa2和Tubb5大小分別為1020bp和1335bp。行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果可見Anxa2樣品條帶約為1000bp左右，Tubb5樣品條帶約為1300bp左右，與預期結果相同，PCR擴增成功。
　　 2．pGM

7、T-Anxa2/pGMT-Tubb5克隆載體鑒定：pGMT-Anxa2/pGMT-Tubb5質粒樣品行1％瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下觀看均有亮帶，示有質粒提出；選取最亮條帶的質粒樣品行序列測定，結果示克隆載體pGMT-Anxa2/pGMT-Tubb5構建正確。
　　 3．PCR擴增出Anxa2-flag和Tubb5-flag片段：Anxa2-flag和Tubb5-flag的大小分別為1044bp和1359bp。行1％瓊脂糖凝膠電泳

8、，可見Anxa2-flag條帶在1000-1100bp之間，Tubb5-flag條帶在1300-1400bp之間，與預期結果相同，PCR擴增成功。
　　 4．重組質粒的鑒定：以重組質粒pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag和pcDNA3.1(+)-Tubb5-flag為模板行PCR，產生約為1044bp和1359bp的條帶；質粒經HindⅢ和NotⅠ雙酶切鑒定，可分別切開約為1044bp和1359bp的小片段；酶切鑒定正確

9、者行序列測定，結果示重組質粒pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag和pcDNA3.1(+)-Tubb5-flag構建成功。
　　 5．細胞免疫熒光檢測目的蛋白及細胞內定位：pcDNA3.1(+)-Anxa2-flag組FITC激發(fā)后產生綠色熒光，指示目的蛋白annexinⅡ有穩(wěn)定表達，并且廣泛均勻分布于胞質和胞膜；pcDNA3.1(+)-Tubb5-flag組，FITC激發(fā)后亦有綠色熒光，廣泛分布于胞質和胞膜，指示目的蛋白

10、tubulin beta-5表達。兩組實驗中轉染pcDNA3.1(+)空載體組和陰性對照組的HEK293細胞內均未檢測到標記目的蛋白熒光信號。
　　 6．Western blot法檢測annexinⅡ蛋白和tubulin beta-5蛋白的表達：pCDNA3.1(+)-Anxa2-flag和pCDNA3.1(+)-Tubb5-flag表達載體組分別在相對分子質量約為36KD、50KD處出現單一蛋白條帶，pcDNA3.1(+)空載