大鼠寡霉素敏感相關(guān)蛋白的克隆與真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、目的：心血管疾病由于其發(fā)病率和病死率很高，已成為危害人類健康的頭號殺手，而細(xì)胞能量代謝障礙又是引發(fā)心血管疾病的重要原因，尋求有效治療細(xì)胞能量代謝障礙的藥物，是當(dāng)前研究的熱點。寡霉素敏感相關(guān)蛋白(OSCP)作為ATP合酶的一個重要亞基，在細(xì)胞能量代謝中發(fā)揮著重要作用。缺血預(yù)適應(yīng)(IPC)對缺血心肌的保護(hù)作用與ATP合酶活性的升高有密切關(guān)系。本實驗采用基因工程的方法克隆ATP合酶中的OSCP基因，并構(gòu)建其真核表達(dá)載體，這為以后對該基因在真核

2、細(xì)胞中過表達(dá)、蛋白活性的檢測以及研究OSCP在細(xì)胞能量代謝、IPC中的作用奠定了基礎(chǔ)。 方法：1.擴(kuò)增大鼠OSCP基因：首先取SD大鼠腦組織50mg左右，依照Trizol試劑說明書中步驟提取總RNA。根據(jù)OSCP基因的開放閱讀框設(shè)計合成一對引物。用RT-PCR方法擴(kuò)增出編碼OSCP基因的全長序列，分離純化PCR產(chǎn)物。2.構(gòu)建重組克隆載體pTA2-OSCP：將PCR產(chǎn)物與pTA2克隆載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliJM109感

3、受態(tài)細(xì)菌，搖菌擴(kuò)增，提取質(zhì)粒DNA，用EcoRI進(jìn)行酶切鑒定，篩選出陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測定，測序結(jié)果用GeneRunner軟件分析。3.構(gòu)建重組表達(dá)載體pEGFP-N1-OSCP：重組質(zhì)粒pTA2-OSCP和真核表達(dá)載體pEGFP-N1分別經(jīng)BglII/EcoRI酶切，然后通過T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化入E.coliDH50α感受態(tài)細(xì)菌，搖菌擴(kuò)增，提取質(zhì)粒DNA。經(jīng)BglII/EcoRI酶切鑒定，篩選出陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測定，

4、測序結(jié)果用GeneRunner軟件分析。 結(jié)果：1.OSCP基因的的RT-PCR擴(kuò)增：總RNA的OD260nm/OD280nm為1.87，純度符合實驗要求；甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明所提總RNA的完整性好：瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示RT-PCR產(chǎn)物的長度約為700bp，與預(yù)期結(jié)果相符。2.重組克隆載體pTA2-OSCP的鑒定：重組克隆載體pTA2-OSCP經(jīng)EcoRI限制性內(nèi)切酶鑒定，得到約3000bp的線性片段和約700bp的

5、插入片段，與預(yù)期結(jié)果相符；選取陽性克隆載體進(jìn)行測序，與已公布的大鼠OSCP基因序列比較分析，同源性為100％。證明pTA2-OSCP重組克隆載體構(gòu)建成功。3.重組表達(dá)載體pEGFP-N1-OSCP的鑒定：重組表達(dá)載體pEGFP-N1-OSCP經(jīng)BglII/EcoRI雙酶切得到約為4700bp的線性片段和約700bp的插入片段，與預(yù)期結(jié)果相符；選取陽性重組表達(dá)載體進(jìn)行測序分析，與已公布的大鼠OSCP基因序列比較，同源性為100％。證明重組