大鼠急性心肌缺血心臟和背根神經(jīng)節(jié)差異蛋白質(zhì)組學(xué)和mRNA研究.pdf

1、目的：心肌缺血不是一個獨立的病理過程，作為傷害性刺激可以激活傷害性感受器?；诩毙孕募∪毖梢鸨掣窠?jīng)節(jié)P 物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽等物質(zhì)表達(dá)改變的前期研究結(jié)果，本課題研究急性心肌缺血后心臟和背根神經(jīng)節(jié)的差異蛋白質(zhì)和mRNA水平，研究去除辣椒素敏感感覺神經(jīng)（capsaicin sensitive nerves denervation）后心臟和背根神經(jīng)節(jié)的差異蛋白質(zhì)和mRNA，旨在探討心肌缺血或去神經(jīng)對心臟和背根神經(jīng)節(jié)的影響、以及發(fā)現(xiàn)心臟

2、和背根神經(jīng)節(jié)之間新的關(guān)系點。
　　 方法：選用新生48 h-72 h 雄性SD大鼠，注射辣椒素（50mg/kg），制備去辣椒素敏感感覺神經(jīng)（簡稱“去神經(jīng)”）大鼠模型，通過大鼠的甩尾反射潛伏期時間評估模型。選用270g±20g雄性SD大鼠，結(jié)扎冠狀動脈左前降支，制備急性心肌缺血模型（coronary artery occlusion，CAO），通過觀察缺血心肌顏色和心電圖評估模型。大鼠隨機分為：正常大鼠假手術(shù)3h組（N-Sham3

3、h）、正常大鼠心肌缺血3h組（N-CAO3h）、正常大鼠假手術(shù)6h組（N-Sham6h）、正常大鼠心肌缺血6h組（N-CAO6h）、去神經(jīng)大鼠假手術(shù)3h組（D-Sham3h）、去神經(jīng)大鼠心肌缺血3h組（D-CAO3h）、去神經(jīng)大鼠假手術(shù)6h組（D-Sham6h）、去神經(jīng)大鼠心肌缺血6h組（D-CAO6h），共計8組，各組3只大鼠。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)篩選8組心臟和背根神經(jīng)節(jié)（胸段T1-T5）的差異蛋白質(zhì)。具體方法是：制備組織的蛋白質(zhì)樣品，依次

4、行等電聚焦電泳、SDS 電泳、銀染凝膠、雙向電泳圖譜采集和統(tǒng)計分析、切取差異蛋白質(zhì)斑點、酶切和肽段提取、HDMS的液相質(zhì)譜分析。根據(jù)差異蛋白質(zhì)斑點的質(zhì)譜鑒定結(jié)果，Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，分別提取8組心臟和背根神經(jīng)節(jié)組織總RNA，鑒定RNA 純度，PCR 擴(kuò)增，Pfaffl 法計算目的基因的相對表達(dá)量，SPSS13.0統(tǒng)計軟件t 檢驗分析。
　　 結(jié)果：去神經(jīng)大鼠模型的甩尾反射潛伏期時間明顯延長，有統(tǒng)計學(xué)

5、差異（P＜0.01），說明制備的去神經(jīng)大鼠模型獲得成功。急性心肌缺血模型結(jié)扎冠狀動脈前降支后心肌缺血區(qū)域顏色明顯變白，心電圖顯示ST 段抬高，T 波變寬大、畸形，符合急性心肌缺血的心電圖特征，造模成功。在心臟篩選出7個蛋白質(zhì)，鑒定為5種，分別為：Cu-Zn 超氧化物岐化酶（SOD1）、晶狀體蛋白（Cryab）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-P(GST-P)、短鏈?；o酶A 脫氫酶（SCAD）、NADP-異檸檬酸脫氫酶（NADP-ICDH）前體。在

6、背根神經(jīng)節(jié)鑒定出5種蛋白質(zhì)，分別為：GST-P、Cryab、ATP 合酶α亞基（Atp5a1）前體、親環(huán)素A（Cyp A）和碳酸酐酶-2（CA2）。在心臟和背根神經(jīng)節(jié)均鑒定出Cryab。心肌缺血時心臟Cryab蛋白質(zhì)出現(xiàn)三種形式，分別為（以軟件生成的編號來區(qū)分）：點5105（分子量30Kda，等電點6.98）、點5106（分子量32.5KDa，等電點7.02）、點5111（分子量30.2 Kda，等電點7.27）。點5106在心臟的8個

7、組別中均有表達(dá)；與假手術(shù)組相比，點5106在急性心肌缺血時上調(diào)。點5105只在N-CAO6h、D-CAO6h中出現(xiàn)，其余組別未見。點5111在N-Sham3h、N-Sham6h、D-Sham3h、D-Sham6h中均未見，但是N-CAO3h、N-CAO6h、D-CAO3h、D-CAO6h中均有表達(dá)。心肌缺血時正常大鼠心臟缺血區(qū)域發(fā)生明顯變化的點有：SOD1的N-CAO6h與N-Sham6h 相比較出現(xiàn)顯著下調(diào)（P＜0.05）；點5106

8、和點5111Cryab的N-CAO3h與N-Sham3h 相比較出現(xiàn)顯著上調(diào)（P＜0.05），點5105、點5106和點5111Cryab的N-CAO6h與N-Sham6h 相比較出現(xiàn)顯著上調(diào)（P＜0.05 或P＜0.01）；GST-P的N-CAO6h與N-Sham6h相比較出現(xiàn)顯著下調(diào)（P＜0.05）；SCAD的N-CAO6h與N-Sham6h 相比較出現(xiàn)顯著上調(diào)（P＜0.05）；NADP-ICDH 前體的N-CAO6h與N-Sham

9、6h 相比較出現(xiàn)顯著下調(diào)（P＜0.05）。心肌缺血時正常大鼠背根神經(jīng)節(jié)發(fā)生明顯變化的點有：Cryab的N-CAO6h與N-Sham6h 相比較出現(xiàn)顯著下調(diào)（P＜0.05）；Atp5a1前體的N-CAO3h與N-Sham3h 相比較出現(xiàn)顯著下調(diào)（P＜0.05）。心肌缺血時去神經(jīng)大鼠心臟缺血區(qū)域發(fā)生明顯變化的點有：點5106和點5111Cryab的D-CAO3h與D-Sham3h 相比較出現(xiàn)顯著上調(diào)（P＜0.05），點5105和點5111C

10、ryab的D-CAO6h與D-Sham6h 相比較出現(xiàn)顯著上調(diào)（P＜0.05）；GST-P的N-CAO3h與N-Sham3h 相比較出現(xiàn)顯著下調(diào)（P＜0.05）；SCAD的N-CAO6h與N-Sham6h 相比較出現(xiàn)顯著上調(diào)（P＜0.01）；NADP-ICDH 前體的N-CAO6h與N-Sham6h 相比較出現(xiàn)顯著下調(diào)（P＜0.05）。心肌缺血時去神經(jīng)大鼠背根神經(jīng)節(jié)發(fā)生明顯變化的點有：Cyp A的D-CAO3h與D-Sham3h 相比較

11、出現(xiàn)顯著上調(diào)（P＜0.05），Cyp A的D-CAO6h與D-Sham6h 相比較出現(xiàn)顯著上調(diào)（P＜0.05）；CA2的D-CAO3h與D-Sham3h 相比較出現(xiàn)顯著下調(diào)（P＜0.01）。去神經(jīng)與正常大鼠比較，由于去神經(jīng)的作用引起心臟蛋白質(zhì)發(fā)生明顯變化的有：Cryab和SOD1；由于去神經(jīng)的作用引起背根神經(jīng)節(jié)蛋白質(zhì)發(fā)生明顯變化的有：Atp5a1前體和GST-P。在正常大鼠和去神經(jīng)大鼠中，實時熒光定量PCR 結(jié)果與蛋白質(zhì)趨勢都一致的點有

12、：SOD1和SCAD，它們蛋白質(zhì)水平主要依靠mRNA 來調(diào)控。
　　 結(jié)論：急性心肌缺血SOD1的降低可能加重超氧化物的聚集；去神經(jīng)大鼠的SOD1基礎(chǔ)水平較低，提示去神經(jīng)大鼠清除超氧化物的能力降低；心臟SOD1蛋白質(zhì)水平主要依靠mRNA水平調(diào)控；在正常大鼠，感覺神經(jīng)可能參與調(diào)控心臟SOD1。心臟Cryab蛋白質(zhì)出現(xiàn)了三種形式；心肌缺血時背根神經(jīng)節(jié)的Cryab 可能通過軸索到達(dá)心臟。心肌缺血致使GST-P降低；心臟缺血對背根神經(jīng)節(jié)

13、的GST-P蛋白質(zhì)水平無影響。心肌缺血SCAD上調(diào)；NADP-ICDH前體下調(diào)，消耗的NADP-ICDH 前體可能用于產(chǎn)生大量的NADP-ICDH。心肌缺血引起缺血3h 背根神經(jīng)節(jié)Atp5a1前體急劇下降，說明其可能用于生成ATP 合成酶。心臟SOD1、Cryab、GST-P、SCAD、NADP-ICDH (mitochondria) 前體是大鼠急性心肌缺血時心臟發(fā)生變化的蛋白質(zhì)。DRG的Cryab、Atp5a1前體是大鼠急性心肌缺血時