非酒精性脂肪性肝病模型中鋅指蛋白A20的表達、作用機制研究及藥物干預(yù).pdf

1、第一部分游離脂肪酸誘導(dǎo)HepG2細胞脂肪變模型中鋅指蛋白A20的表達及作用機制
　　目的：探討游離脂肪酸（FFAs）誘導(dǎo)的HepG2細胞脂肪變模型中A20的表達及其作用機制。
　　方法：以不同濃度混合FFAs（油酸：軟脂酸=2:1）誘導(dǎo)HepG2細胞，MTS法測定細胞活力，油紅O染色鑒定脂肪沉積，并測定細胞內(nèi)甘油三酯（TG）含量，篩出合適的干預(yù)濃度。免疫印跡法檢測A20、pIκB、p65p表達，流式細胞儀測定細胞上清中IL-

2、8的含量。
　　結(jié)果：0.125-0.5mM FFAs對HepG2細胞生長沒有明顯抑制作用，1.0、2.0mM FFAs對細胞毒性較大。與對照組相比，油紅O染色后可見細胞內(nèi)紅色脂滴，在0.125～0.5mM FFAs范圍內(nèi)，隨著作用時間延長，染色脂質(zhì)增多，且細胞內(nèi)TG含量增加（P<0.05），1.0、2.0mM FFAs作用24h時細胞浮起死亡較多，染色脂質(zhì)減少，TG含量下降，故選擇0.25或0.5mM作為干預(yù)濃度。隨著FFAs濃

3、度增高，A20表達在6 h呈增加趨勢，而12 h、24 h時A20表達呈先減少后增加的趨勢，0.5 mmol/L是分界點。當(dāng)0.5mM FFAs干預(yù)時，A20、pIκB、p65p在4h、6h時表達明顯增加，相應(yīng)的細胞上清中IL-8含量明顯增加（P<0.05）。
　　結(jié)論：FFAs能誘導(dǎo)HepG2細胞鋅指蛋白A20表達，可能是通過激活NF-κB信號通路實現(xiàn)的。
　　第二部分沉默人A20基因?qū)χ咀僅epG2細胞的影響
　

4、　目的：構(gòu)建人A20基因缺陷穩(wěn)定細胞系，探討A20表達對脂肪變HepG2細胞的影響。
　　方法：根據(jù)人A20基因mRNA序列設(shè)計并合成3條互補的DNA單鏈寡核苷酸，分別為sh1、sh2、sh3，重組到pGIPZ慢病毒載體，形成慢病毒真核表達載體，通過轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝成慢病毒。將此慢病毒感染HepG2細胞，經(jīng)過puromycin篩選后，免疫印跡法鑒定A20表達。經(jīng)0.5mM FFAs干預(yù)最佳穩(wěn)定細胞系后，免疫印跡法鑒定A20表

5、達，測定細胞內(nèi)TG含量，流式細胞儀檢測細胞上清中IL-8的含量。
　　結(jié)果：目的序列成功插入pGIPZ慢病毒載體并包裝成高滴度的慢病毒，三條序列均能抑制A20表達，其中sh3的抑制率最高，選為后續(xù)最佳沉默穩(wěn)定細胞系。與對照組相比，A20缺陷后 IL-8分泌顯著增加（P<0.05），細胞內(nèi) TG含量無差別（P>0.05）。當(dāng)0.5mM FFAs干預(yù)后，A20的表達呈現(xiàn)瞬時性，在1、4、6h表達增強，IL-8和TG水平均明顯增高（P<

6、0.05）。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建人A20基因缺陷穩(wěn)定細胞系。沉默A20可促進HepG2細胞炎癥因子IL-8分泌，增加脂肪沉積，A20對肝細胞可能具有保護作用，為NAFLD的防治提供潛在的靶點。
　　第三部分非酒精性脂肪性肝炎動物模型中A20的表達
　　目的：建立蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）小鼠模型，探討該模型中A20的表達。方法：將18只6周齡、雄性C57/BL6小鼠隨機分為對照組（

7、n=8）、MCD飲食組（n=10），分別給予普通飼料、MCD飲食，喂養(yǎng)6周后處死，分別取脂肪組織稱重、肝臟組織行組織學(xué)鑒定和勻漿處理，并檢測血清中FFA、ALT、AST、TG、TC和肝組織勻漿中FFA、TG、TC含量及血清炎癥因子表達，免疫印跡法檢測肝組織A20的表達。結(jié)果：與對照組相比，MCD組體重、肝指數(shù)、脂肪指數(shù)明顯下降（P<0.01），組織病理切片HE染色可見明顯脂肪變、氣球樣變、小葉炎癥，測得血清中ALT、AST升高（P<0.

8、01），TG、TC下降（P<0.01）；IL-6升高（P<0.05），而FFA、MCP-1、IFN-γ未見明顯變化（P>0.05）；肝內(nèi)FFA升高（P<0.01），TG、TC無明顯差異（P>0.05），免疫印跡可見MCD組A20表達呈現(xiàn)雙條帶，而對照組只出現(xiàn)單條帶，半定量后MCD組比對照組 A20的表達顯著增高（P<0.01）；結(jié)論：在MCD飲食成功誘導(dǎo)的NASH模型中，小鼠肝組織內(nèi)A20表達明顯增高，A20對肝組織可能具有保護作用。<

9、br>　　第四部分藥物干預(yù)對非酒精性脂肪性肝病模型中A20表達的影響
　　目的：姜黃素和多烯磷脂酰膽堿（PPC）分別干預(yù)NAFLD體內(nèi)、外模型，觀察A20的變化。方法：1.用不同濃度的姜黃素、PPC分別預(yù)刺激HepG2細胞24h，再分別與0.25mM FFAs共孵育HepG2細胞6h，免疫印跡法檢測A20表達，并測定相應(yīng)細胞上清中IL-8、細胞內(nèi)TG的含量；2.將38只6周齡、雄性C57/BL6小鼠隨機分為對照組、MCD組、姜黃素

10、組、PPC組，除對照組8只外，其余各組均為10只，對照組給予普通飼料、其余組給予 MCD飲食，喂養(yǎng)1周后藥物組按姜黃素（1000mg/kg）、PPC（912mg/kg）0.1ml/10g每天灌胃一次處理，對照組和 MCD組給予同等劑量生理鹽水，6周后全部處死，分別取脂肪組織稱重，肝臟組織行HE染色鑒定和組織勻漿，并檢測血清中FFA、ALT、AST、TG、TC和肝組織勻漿中FFA、TG、TC含量及血清炎癥因子表達，免疫印跡法檢測肝組織A2

11、0的表達。結(jié)果：1.體外實驗發(fā)現(xiàn)與對照組相比，0.25mM FFAs組 A20表達增加，且細胞上清中 IL-8和TG含量增加（P<0.05）；與0.25mM FFAs組相比，20、25μmmol/L姜黃素混合組A20表達明顯受抑制，而80、160μmmol/L PPC混合組A20表達明顯增加，但細胞上清中IL-8和TG含量均下降（P<0.05）。2.體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)與MCD組相比，藥物組循環(huán)中炎癥因子均無顯著差異（P>0.05）；姜黃素組肝

12、指數(shù)高于MCD組（P<0.01），但脂肪指數(shù)卻相反，甚至低于對照組（P<0.01）；與MCD組比較，姜黃素血清中FFA降低（P<0.01），ALT、AST、TG、TC無改善作用（P>0.05），肝組織內(nèi)FFA比對照組高（P<0.01），TG、TC均無顯著差異（P>0.05）；PPC組的肝指數(shù)比MCD組、對照組均低（P<0.01），脂肪指數(shù)低于對照組（P<0.01）；與MCD組比較，PPC組血清中FFA、ALT降低（P<0.05），而TC

13、高于MCD組（P<0.01），但比對照組低（P<0.01），TG比對照組低（P<0.01），肝組織內(nèi)FFA比對照組高（P<0.01），TC高于MCD組（P<0.01），TG均無顯著差異（P>0.05）。HE染色見姜黃素組肝內(nèi)炎癥細胞聚集明顯減少，脂肪變性得到改善；肝組織內(nèi)A20的表達量比MCD組要顯著減少（P<0.05），但是仍呈現(xiàn)雙條帶。PPC組肝內(nèi)炎癥細胞顯著減少，脂肪變性不明顯，小葉結(jié)構(gòu)完整，細胞壞死較少；肝組織內(nèi)A20表達比MC