ER-AR+乳腺癌細(xì)胞中AR活化信號相關(guān)miRNA及其靶蛋白的研究.pdf

1、研究背景:
　　作為性激素依賴性的腫瘤，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率均居女性惡性腫瘤的首位，一直以來都是腫瘤研究者關(guān)注的重點(diǎn)。相對于雌激素受體(estrogenreceptor, ER)和孕激素受體(progesterone receptor, PR)，雄激素受體(androgenreceptor, AR)在乳腺癌生物學(xué)中的作用是臨床和基礎(chǔ)研究中被忽略的領(lǐng)域。近年來國外越來越多的實(shí)驗(yàn)研究表明AR與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。國內(nèi)外

2、的許多文獻(xiàn)報(bào)告結(jié)果顯示，AR高表達(dá)于乳腺癌，在ER陰性的病例有大約1/2的病例AR是陽性的，而且AR陽性乳腺癌患者的臨床過程和預(yù)后較好。因此搞清AR在乳腺癌中的作用機(jī)制，對進(jìn)一步認(rèn)識乳腺癌的生物學(xué)行為及發(fā)展新的治療方法有著重要意義。
　　已有的研究表明AR通過與雄激素反應(yīng)元件結(jié)合而活化，從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)程序，包括微小RNA(micro-ribonucleic acid，microRNA，miRNA)的改變

3、，而近年來非編碼的具有重要調(diào)控作用的miRNA正是腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，由于miRNA的改變可以負(fù)調(diào)控其靶蛋白的表達(dá)，因此其既可作為抑癌基因，下調(diào)原癌基因的活性;也可作為癌基因，下調(diào)抑癌基因的活性。
　　我們的前期研究結(jié)果顯示，雄激素二氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)可以抑制ER-AR+MDA-MB-453乳腺癌細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期阻滯在G1-S期，提高AR蛋白的表達(dá)，miRNA芯片雜交結(jié)果篩選出明顯上調(diào)和下

4、調(diào)的miRNA。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，從篩選出的miRNA中找到有意義的2個(gè)miRNA進(jìn)行了深入研究并取得了一些重要發(fā)現(xiàn)。
　　研究目的:
　　1.明確let-7a與AR活化之間的相關(guān)性，并對let-7a進(jìn)行細(xì)胞功能學(xué)研究，闡明AR活化、let-7a及其靶蛋白在DHT抑制ER-AR+乳腺癌細(xì)胞增殖中的重要作用。
　　2.明確miR-30a與AR活化之間的相關(guān)性，對miR-30a進(jìn)行細(xì)胞功能學(xué)研究，證實(shí)其靶蛋白是否為

5、通過生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)的AR，闡明AR和miR-30a之間的關(guān)系及其在DHT抑制ER-AR+乳腺癌細(xì)胞增殖中的重要作用。
　　研究方法:
　　1.分析miRNA芯片雜交結(jié)果，生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測靶基因?yàn)锳R的可能miRNA。
　　2.采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法，驗(yàn)證miRNA芯片雜交篩選出的明顯上調(diào)的miRNAlet-7a和明顯下調(diào)的miR-30a，b，c。
　　3.染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)證實(shí)AR活化與let-7a和

6、miR-30a啟動(dòng)子的相互作用。
　　4.通過Western blot技術(shù)檢測乳腺癌細(xì)胞中AR、c-Myc和k-Ras蛋白的表達(dá)。
　　5.通過構(gòu)建質(zhì)粒和細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)使細(xì)胞中的miRNA上調(diào)。
　　6.通過轉(zhuǎn)染miRNA特異性反義寡核苷酸(specific antisense oligonucleotide，ASO)使細(xì)胞中的miRNA下調(diào)。
　　7.MTT和流式細(xì)胞術(shù)方法檢測細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的變化。
　

7、　8.應(yīng)用雙熒光蛋白報(bào)告基因分析系統(tǒng)證實(shí)AR為miR-30a的靶基因。
　　研究結(jié)果:
　　1.對miRNA芯片雜交篩選出的miRNA結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)大于1.5倍，的miRNA有43個(gè)，其中包括let-7a,b，c，d，e，g六個(gè)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)只有其中的let-7a，b，c，d為上調(diào)大于2倍，且信號值大于1000的miRNA;下調(diào)大于1.5倍的miRNA有51個(gè)，其中包括miR-30a,b，c。
　　2.生物信息

8、學(xué)預(yù)測軟件預(yù)測靶基因?yàn)锳R的可能的且在miRNA芯片雜交篩選出的有意義的miRNA為miR-30a，b，c。
　　3.對let-7a及miR-30a，b，c進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR，結(jié)果顯示let-7a的上調(diào)倍數(shù)近13倍，miR-30a下調(diào)5倍，miR-30b下調(diào)大于2倍，miR-30c下調(diào)接近2倍，選擇上調(diào)的let-7a及下調(diào)的miR-30a進(jìn)一步研究。
　　4.染色質(zhì)免疫沉淀證實(shí)了AR活化后可以直接上調(diào)let-7a，但不

9、直接調(diào)節(jié)miR-30a。
　　5.DHT刺激MDA-MB-453細(xì)胞后，c-Myc和k-Ras表達(dá)下調(diào)，AR表達(dá)上調(diào)。
　　6.實(shí)時(shí)定量RT-PCR證實(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功，與對照組相比，在轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒組let-7a和miR-30表達(dá)上調(diào)，轉(zhuǎn)染ASO組let-7a和miR-30表達(dá)下調(diào)
　　7.MDA-MB-453細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，在let-7a低表達(dá)組，細(xì)胞增殖活性增高;細(xì)胞周期中S期細(xì)胞比例增加，G1期細(xì)胞比例減少;let-7

10、a的已知靶蛋白c-Myc和k-Ras表達(dá)上調(diào)。在let-7a高表達(dá)組，則出現(xiàn)相反的結(jié)果。
　　8.MDA-MB-453細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，在miR-30a低表達(dá)組，細(xì)胞增殖活性增高;細(xì)胞周期中S期細(xì)胞比例增加，G1期細(xì)胞比例減少，預(yù)測的靶蛋白AR表達(dá)上調(diào)。在miR-30a高表達(dá)組，則出現(xiàn)相反的結(jié)果。
　　9.雙熒光蛋白報(bào)告基因分析系統(tǒng)證實(shí)了AR為miR-30a的靶基因。
　　結(jié)論:
　　1.作為轉(zhuǎn)錄因子AR活化可以作用于

11、let-7a的啟動(dòng)子直接上調(diào)let-7a。
　　2.AR是miR-30a的靶蛋白，受miR-30a的直接調(diào)控。
　　3.let-7a和miR-30a均為抑癌miRNA。
　　4.雄激素誘導(dǎo)的AR活化直接上調(diào)let-7a，let-7a又下調(diào)其靶蛋白c-Myc和k-Ras，這一信號通路雄激素抑制ER-AR+乳腺癌細(xì)胞生長過程中發(fā)揮重要作用。
　　5.miR-30a為抑癌miRNA，而雄激素誘導(dǎo)的AR活化可以下調(diào)miR