以PCR為基礎的BCG菌株基因分型及BCG DNA中CpG含量的測定.pdf

1、目的：對目前國內卡介苗（BCG）生產用株進行基因分型，檢測BCG DNA中胞嘧啶-鳥嘌呤（CpG）的含量。 方法：收集菌體分別經機械破碎或溶菌處理，用溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）進行沉淀，再經酚：氯仿：異戊醇抽提，對所得DNA進行紫外掃描、凝膠電泳檢測。主要采用PCR技術對11種BCG菌株及對比株提取的DNA進行體外擴增,引物針對BCG菌株某些特異性缺失及擴增染色體片段而設計，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增情況，并對所得產物進行

2、測序鑒定。以CpG特異的甲基化酶（CpG Methylase）M.SssI對BCG DNA進行修飾，將CpG中的胞嘧啶（C）轉化為5-甲基胞嘧啶（MC），利用限制性內切酶HpaⅡ進行消化以檢測甲基化程度，甲基化完全的DNA經相關酶水解后應用反相高效液相色譜（RP-HPLC）方法檢測樣品中CpG的質量百分含量。 結果：機械破碎抽提BCG DNA產率高、純度高，溶菌處理抽提DNA完整性好。在BCG相關片段的PCR擴增中，國內BCG生

3、產用株均顯示相同PCR結果，SenX3-regX3擴增片段為353 bp，RD Denmark/Glaxo擴增產物分別為281 bp（AL/AR）、1637 bp（BL/BR），nRD18擴增產物分別為655 bp（AL/AR）、406 bp（L/R/wtR），IS6110 copyⅡ擴增產物417 bp，RD2及nRD18（AL/CR）擴增無產物。BCG 上海新菌種DNA樣品的CpG質量百分含量為23.61％，巴斯德株抽提DNA樣品的

4、CpG質量百分含量為23.53％。 結論：CTAB沉淀是一種比較簡便易行的BCG DNA提取方法。國內BCG生產用株均顯示相同基因型，特異性缺失RD2，nRD18和RD Denmark/Glaxo均存在，IS6110為單拷貝，senX3-regX3基因間區(qū)域的77-bp分枝桿菌散在分布重復單位（MIRUs）為三重拷貝。在目前具有代表性的國際公認菌株中未能找到與國內株基因型匹配者。采用甲基化特異酶修飾、酶水解、RP-HPLC的方法