豬瘟病毒石門株和疫苗C株嵌合病毒構(gòu)建及其特性鑒定.pdf

1、豬瘟是豬的重要傳染病，具有致死性及高度傳染性等特點(diǎn)，其病原為豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)，為黃病毒科瘟病毒屬成員，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒。CSFV基因組長約12.3kb，基因組兩端為非編碼區(qū)，編碼區(qū)為一個(gè)11697bp的開放性閱讀框，編碼長度為3898個(gè)氨基酸的多聚前體蛋白，在宿主細(xì)胞蛋白酶的作用下逐步裂解為8種非結(jié)構(gòu)蛋白和4種結(jié)構(gòu)蛋白，基因組內(nèi)的順序依次為Npro、Core、Ern

2、s、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，其中Core、Erns、E1和E2為結(jié)構(gòu)蛋白。對(duì)CSFV主要蛋白的功能研究已較為深入，在病毒復(fù)制及其與宿主細(xì)胞互作研究方面也取得了進(jìn)展，這些研究成果得益于感染性克隆技術(shù)發(fā)展。
　　以疫苗C株作為骨架進(jìn)行新型豬瘟標(biāo)記疫苗的開發(fā)是一大研究熱點(diǎn)，但相對(duì)于強(qiáng)毒株，C株病毒本身在體外培養(yǎng)細(xì)胞中的生長較慢。我們發(fā)現(xiàn)以C株感染性克隆為基礎(chǔ)拯救的重組病毒滴度較低，可能與

3、其細(xì)胞適應(yīng)性差有關(guān)。本研究擬在C株和強(qiáng)毒株石門株感染性克隆的基礎(chǔ)上，通過對(duì)兩個(gè)毒株不同蛋白區(qū)段進(jìn)行相互置換，構(gòu)建一系列重組嵌合病毒，以研究結(jié)構(gòu)蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)豬瘟病毒細(xì)胞適應(yīng)性的影響，解析影響豬瘟病毒在ST細(xì)胞和PK-15細(xì)胞中復(fù)制的重要蛋白，為從基因水平上對(duì)疫苗C株進(jìn)行改造提供依據(jù)，也為進(jìn)一步探索豬瘟病毒體外復(fù)制和組裝機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　1.重組C株高低代次毒株與石門株體外增殖能力差異比較
　　在相同感染比條件下，無論是

4、高代次還是低代次重組C株病毒(RecCpp40和RecCpp80)在細(xì)胞內(nèi)的增殖能力均弱于石門株，但三株病毒感染過程中基因組復(fù)制水平差異不明顯(P＞0.05)。感染后96h RecCpp80的子代病毒數(shù)量是RecCpp40的30倍以上(P＜0.01);感染后96h細(xì)胞外病毒粒子數(shù)比較結(jié)果顯示，胞內(nèi)病毒增殖能力與釋放到胞外的病毒量成正比，石門株胞內(nèi)增殖能力強(qiáng)，釋放到胞外的病毒粒子數(shù)也顯著高于重組C株病毒(P＜0.05);石門毒株C株細(xì)胞間

5、的擴(kuò)散能力顯著優(yōu)于RecCpp80，特別是在覆蓋瓊脂糖的情況下，石門毒株的擴(kuò)散能力受瓊脂培養(yǎng)基的影響較小，在兩種培養(yǎng)條件下均能形成大而彌散的病毒斑。因此，我們推測C株與石門株之間的細(xì)胞適應(yīng)性差異主要與病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖能力及其細(xì)胞間擴(kuò)散能力相關(guān)。
　　2.豬瘟病毒C株與石門株嵌合病毒構(gòu)楚及其細(xì)胞內(nèi)增殖能力和兔體反應(yīng)比較
　　為了解析不同毒株體外增殖能力差異的分子基礎(chǔ)，我們構(gòu)建了石門株的感染性克隆，并以疫苗C株和石門株感染性克

6、隆為基礎(chǔ)構(gòu)建了豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因互換的感染性克隆，并成功拯救了石門株重組病毒和11個(gè)重組嵌合豬瘟病毒。體外生長特性比較結(jié)果顯示，疫苗C株和石門株半長基因組的相互置換可提高C株病毒的體外增殖能力，其中置換有石門株非結(jié)構(gòu)蛋白至非編碼區(qū)半長的嵌合毒株與C株重組病毒RecCpp80相似。置換石門毒株NS2-NS4B的重組嵌合C株病毒體外增殖能力顯著提高，而置換有C株NS2-NS4B區(qū)段嵌合石門毒株的體外增殖能力低于親本石門重組

7、病毒，說明非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-NS4B區(qū)段對(duì)豬瘟病毒的體外增殖具有重要作用。置換石門毒株NS4A-3-UTR片段或NS5A-3-UTR，不增強(qiáng)C株嵌合病毒的體外增殖能力。為了評(píng)價(jià)基因置換對(duì)疫苗C株兔體適應(yīng)性的影響，將嵌合毒株進(jìn)行了兔體接種實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，分別含有C株前半長（結(jié)構(gòu)蛋白）或后半長（非結(jié)構(gòu)蛋白）基因的嵌合毒株均能夠引起兔定型熱反應(yīng)，含有石門毒株NS2-NS4B基因區(qū)段的嵌合C株病毒亦能引起兔體溫升高反應(yīng)，但置換C株NS4A-3-

8、UTR和NS2-NS4B區(qū)段的嵌合石門毒株則不誘導(dǎo)兔體發(fā)熱反應(yīng)。以上結(jié)果說明C株的兩端非編碼區(qū)以及結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域與兔體適應(yīng)性密切相關(guān)。
　　3.豬瘟病毒NS2跨膜區(qū)在病毒增殖中的作用
　　為了初步解析NS2蛋白在豬瘟病毒增殖中的作用，對(duì)NS2的N端6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)(Transmembrane，TM)序列分別進(jìn)行了PCR擴(kuò)增后，構(gòu)建了12個(gè)含有NS2不同區(qū)段融合表達(dá)GFP的真核表達(dá)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞后比較了不同跨膜區(qū)融合蛋白的亞

9、細(xì)胞定位。結(jié)果表明，NS2蛋白N端不同區(qū)段的跨膜結(jié)構(gòu)均能在定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)網(wǎng)狀分布。以石門株感染性克隆為模板，對(duì)NS2的N端6段潛在跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行單段缺失，或通過在跨膜區(qū)核心序列中央插入丙氨酸改變跨膜區(qū)構(gòu)象，成功構(gòu)建12個(gè)NS2不同突變的感染性克隆，體外轉(zhuǎn)錄RNA電轉(zhuǎn)ST細(xì)胞以拯救重組病毒。結(jié)果顯示，缺失任何一段NS2跨膜結(jié)構(gòu)均導(dǎo)致病毒復(fù)制缺陷，不能產(chǎn)生子代病毒。在TM1正中插入丙氨酸后不影響子代病毒復(fù)制和組裝，在TM3和TM

10、6中相應(yīng)的插入則導(dǎo)致病毒產(chǎn)生時(shí)間延后，在3-4代連續(xù)傳代才能獲得重組病毒;而在TM2，4，5中分別插入突變后，病毒RNA在細(xì)胞內(nèi)呈低水平復(fù)制，且不產(chǎn)生重組病毒。上述結(jié)果說明NS2的跨膜區(qū)在豬瘟病毒復(fù)制和組裝過程中具有重要作用，但作用的具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。
　　綜上所述，我們以豬瘟病毒C株與石門株之間在體外培養(yǎng)細(xì)胞適應(yīng)性差異為切入點(diǎn)，通過結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白基因置換以及NS2蛋白跨膜區(qū)的缺失或丙氨酸插入，探明了非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-