嵌合動脈炎病毒構建及其病毒學特性.pdf

1、1996年成立的動脈炎病毒科(Arteriviridae)其成員包括：馬動脈炎病毒(equine arteritis virus，EAV)，豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)乳酸脫氫酶升高病毒(lactate dehydrogenase-elevating virus，LDV)，猴出血熱病毒(simianhemorrhagic

2、fever virus，SHFV)。動脈炎病毒感染動物后能引起從無臨床癥狀的持續(xù)性感染到致死的急性感染不等的病征。其中PRRSV感染豬引起所謂的“豬藍耳病”給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。目前涉及到動脈炎病毒復制過程的分子機制，尤其是囊膜蛋白結構與功能的關系還不清楚。在本實驗室已經(jīng)擁有的PRRSV和EAV全長感染性克隆的基礎上，本研究利用反向遺傳操作方法對動脈炎病毒的囊膜蛋白功能、基因轉錄調控等進行了解析，促進了對動脈炎病毒的進一步了解，

3、為防治PRRSV及其它動脈炎病毒奠定了一定的理論基礎。
　　 1.不同基因型PRRSV嵌合體的構建及其病毒學特性
　　 PRRSV分為兩個基因型，基因1型與基因2型，兩型之間基因相似性僅為60％左右。對本實驗室擁有的1型PRRSV株vSHE與2型PRRSV株vAPRRSV進行比對發(fā)現(xiàn)其囊膜蛋白GP2a、E、GP3、GP4、GP5之間的相似性在53-76％之間。以2型PRRSV的全長感染性克隆pAPRRS為骨架，先將Asc

4、Ⅰ酶切位點插入ORF1b與ORF2a之間構建全長克隆pAPRRSase。再以pAPRRSasc為骨架，將其ORF2-3、ORF2-4、ORF2-5、ORF5分別替換為vSHE的相應區(qū)域，構建了全長嵌合克隆pAPRRS-SHE23、pAPRRS-SHE234、pAPRRS-SHE2345、pAPRRS-SHE5。用如上構建的嵌合克隆和pAPRRSasc轉染MARC-145細胞，除pAPRRS-SHE23以外均拯救出了相應的感染性子病毒，分

5、別為vAPRRSasc、vAPRRS-SHE234、vAPRRS-SHE2345、vAPRRS-SHE5。間接免疫熒光(IFA)和全長序列測定結果證實了子病毒的嵌合基因組結構。將拯救病毒在體外連續(xù)傳代至第8代后測序表明嵌合病毒有很好的基因穩(wěn)定性。用能特異性識別1型PRRSV囊膜蛋白的抗體進行IFA分析表明1型PRRSV基因能在2型骨架PRRSV中有效表達。對拯救出的嵌合病毒進行病毒學特性研究發(fā)現(xiàn)：除vAPRRS-SHE5外其它嵌合病毒能

6、在MARC-145上形成與骨架親本病毒vAPRRS相似的空斑形態(tài)；所有嵌合病毒在MARC-145上的復制能力與親本病毒相似。這表明1型PRRSV的相應囊膜蛋白能在2型PRRSV中發(fā)揮相同的功能。采用RT-PCR方法和特異性引物對，從病毒感染細胞的總RNA中擴增出各個亞基因組mRNA(subgenomic mRNA，sgmRNA)。序列測定發(fā)現(xiàn)：雖然兩型PRRSV位于結構蛋白基因中的轉錄調控序列(body transcriptionreg

7、ulation sequence，TRS-B)不一致，但是1型TRS-B能與2型的位于5’UTR中的轉錄調控序列(leader transcription regulation sequence，TRS-L)互相作用形成相應的雜合sg mRNA；由于1型TRS-B與2型TRS-L堿基之間的不精確配對導致基因組中一些TRS-B類似序列發(fā)揮作用，產(chǎn)生了一些比經(jīng)典sg mRNA小的亞基因組RNA(sg RNA)。本研究首次獲得了不同基因型PR

8、RSV嵌合的感染性子病毒，闡明了1型PRRSV的囊膜蛋白能在2型PRRSV中發(fā)揮功能，從理論上表明兩型PRRSV之間可能發(fā)生重組。這為進一步研究PRRSV囊膜蛋白結構和功能的關系、開發(fā)基因標記疫苗奠定了理論基礎。
　　 2.不同種動脈炎病毒嵌合體的構建及其病毒學特性
　　 目前對動脈炎病毒細胞受體和病毒結合蛋白的認識還沒有統(tǒng)一，大部分人認為病毒結合蛋白是多量囊膜糖蛋白GP5，而有人提出可能是少量囊膜蛋白。這些結論都是基于

9、體外的生物化學實驗得到，缺乏遺傳學和病毒學上的證據(jù)。已知在體外PRRSV只能感染MARC-145細胞，而EAV能感染MARC-145、BHK-21、Vero等多種細胞。在本項研究中，以上一項研究構建的全長感染性克隆pAPRRSasc為骨架，分別將其ORF2-4、ORF5替換為EAV的相應區(qū)域構建全長嵌合克隆pAPRRS-EAV234、pAPRRS-EAV5。用構建的嵌合克隆轉染MARC-145，發(fā)現(xiàn)克隆pAPRRS-EAV234能拯救出

10、感染性的子病毒vAPRRS-EAV234。通過IFA和全長序列測序分析證實了vAPRRS-EAV234的嵌合基因組結構。對第8代病毒測序表明嵌合病毒在體外具有很好的基因穩(wěn)定性。用特異性識別EAV GP2b的抗體對vAPKRS-EAV234感染細胞進行IFA分析表明嵌入基因能在PRRSV骨架中有效表達。病毒學特性研究發(fā)現(xiàn)：嵌合病毒vAPRRS-EAV234獲得了供體親本病毒EAV的細胞感染譜，除了能感染除MARC-145外還能感染BHK-

11、21和Vero細胞，但不能感染骨架親本病毒PRRSV的體內靶細胞-豬肺泡巨噬細胞(PAM)；vAPRRS-EAV234能在MARC-145和BHK-21上實現(xiàn)良好的增殖，其在BHK-21上的最高病毒滴度為在MARC-145上的10倍。對vAPRRS-EAV234的sg mRNA轉錄譜和sg mRNA序列進行分析發(fā)現(xiàn)：雖然EAV和PRRSV的TRS序列差距很大，但是EAV的TRS-B可以與PRRSV的TRS-L結合；由于EAV的TRS-B

12、與PRRSV的TRS-L之間的不精確配對導致sg mRNA2-4的轉錄量明顯下降；產(chǎn)生了一系列具有潛在編碼價值的新sg RNA，這些sg RNA的意義還未知。本研究不但在世界上首次成功獲得了不同種動脈炎病毒之間完整ORF替換的具有感染性的嵌合病毒，更重要的是首次從遺傳學和病毒學的角度闡明少量囊膜蛋白在動脈炎病毒侵入細胞過程中發(fā)揮決定性作用。該研究同時提供了一種生產(chǎn)高滴度PRRSV的方法，極有利于疫苗生產(chǎn)。
　　 3.插入嵌合體動

13、脈炎病毒的構建及其病毒學特性
　　 上一項的研究表明EAV的ORF2-4可以在PRRSV中穩(wěn)定存在并發(fā)揮功能，且已知另外一個動脈炎病毒SHFV基因組中擁有2套ORF2-4。該項研究在以上研究基礎上以全長感染性克隆pAPRRSasc為骨架，將EAV的ORF2-4插入ORF1b和ORF2a之間，構建了嵌合克隆pAPRRS(EAV234)。用該克隆轉染細胞拯救出了具有感染性的插入嵌合病毒vAPRRS(EAV234)。IFA和核酸序列測

14、定結果均證實了子病毒的基因組結構特點且插入基因能有效表達。研究發(fā)現(xiàn)vAPRRS(EAV234)在EAV ORF2-4穩(wěn)定存在的同時PRRSV自身的ORF2-4卻發(fā)生大范圍的缺失。同時還發(fā)現(xiàn)插入嵌合病毒vAPRRS(EAV234)能感染MARC-145和BHK-21細胞。本研究表明：PRRSV乃至其它動脈炎病毒可以容納2套少量囊膜蛋白基因，但是穩(wěn)定性不強；作為一種潛在外源基因載體，PRRSV可以在ORF1b和ORF2a之間插入較大的外源基