版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、目的:構建真核表達載體pEGFP-N1/Igf1,Igf1與EGFP融合表達。通過脂質體介導pEGFP-N1/Igf1轉染SD大鼠牙囊細胞,分析其對細胞增殖及分化效應的早期影響,為Igf1基因在牙周組織工程修復與再生中的應用提供參考。
方法:1.根據SD大鼠Igf1基因在GeneBank中的序列設計引物。巢氏PCR擴增出目的基因,與pMD-19T載體連接構建pMD-19T/Igf1克隆載體。2.應用限制性內切酶EcoRⅠ及
2、XhoⅠ對pMD-19T/Igf1與pEGFP-N1質粒進行雙酶切。使用連接酶SolutionⅠ連接酶切后的Igf1片段及pEGFP-N1片段。轉化大腸桿菌DH5α后進行PCR、酶切、測序等鑒定。3.原代培養(yǎng)SD大鼠牙囊細胞,細胞傳至第四代時進行來源鑒定。實驗分組:①空白組、②pEGFP-N1/Igf1組、③pEGFP-N1+脂質體組、④pEGFP-N1/Igf1+脂質體組。4.熒光觀察:轉染后每隔24h在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的
3、表達情況,連續(xù)觀察96 h。5.細胞活力檢測(MTT法):96孔板接種細胞,轉染后每隔24 h檢測各組細胞活力,連續(xù)檢測8d。6.ALP定量檢測(比色法):24孔板接種細胞,轉染后每隔24 h收集細胞培養(yǎng)液檢測ALP含量,連續(xù)檢測6d。7.Ⅰ型膠原Col1α1及Col1α2基因表達檢測(熒光定量PCR法):6孔板接種細胞,轉染48 h后收集細胞。以空白組為參照,計算其它處理組基因的相對表達量。
結果:1.經PCR、酶切、測
4、序等鑒定pEGFP-N1/Igf1質粒構建成功。2.綠色熒光觀察情況:轉染后48 h綠色熒光表達量最強。3.細胞增殖活力:轉染48 h-96 h細胞活力均為③④組<①②組(p<0.05)。轉染96 h時:①組<②組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其余時間點差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在轉染48 h時:③組<④組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其余時間點差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。4.胞外ALP活性:整體趨勢:①④兩組
5、較為接近,②組ALP含量在96 h內始終高于其它組,在72 h時達到最峰,③組ALP含量在96 h內始終低于其它組。轉染后24 h時:②組>①組>④組>③組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。轉染后48 h時:②組>④組>①組>③組,除①④兩組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.7>0.5),其余均差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。轉染后72 h時:②組>④組>①組>③組,除①④兩組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.908>0.5),其余均差異均有統(tǒng)
6、計學意義(P<0.05)。轉染后96 h時:②組>①組>④組>③組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。5.Col1α1及Col1以基因表達情況(轉染后48 h): Col1α1相對表達量:④組>②組>①組>③組;Col1α2相對表達量:④組>②組>①組>③組。
結論:
1.成功構建Igf1基因C端融合EGFP的真核表達載體:pEGFP-N1/Igf1質粒。2.脂質體Lipofectamine2000介導的轉
7、染在轉染48 h時目的蛋白的表達最強。3.脂質體Lipofectamine2000對SD大鼠牙囊細胞有一定的細胞毒性。pEGFP-N1/Igf1質粒對細胞增殖有促進作用,裸質粒組在轉染96 h時、脂質體組在轉染48 h時對細胞的促增殖效應最大。4.pEGFP-N1/Igf1質??稍鰪姲釧LP活性,具有一定的促SD大鼠牙囊細胞成骨向分化的作用。脂質體的細胞毒性作用降低了胞外ALP活性,脂質體組pEGFP-N1/Igf1質粒促進ALP表達
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 重組pEGFP-N1-IGF-1質粒在體轉染骨質疏松大鼠的實驗研究.pdf
- pEGFP-N1-H2B1質粒載體轉染對小鼠血管內皮細胞增殖和凋亡的影響.pdf
- 體外大鼠牙囊細胞促大鼠骨髓間充質干細胞增殖和分化的初步研究.pdf
- IGF-1和bFGF對人牙髓干細胞增殖及分化影響的實驗研究.pdf
- IGF-1、GH和Ghrelin對前脂肪細胞增殖和分化的影響.pdf
- 牙囊細胞對健康-炎癥組織來源牙周膜干細胞增殖、分化及干性的影響.pdf
- 重組質粒pegfp-n1-nprl2對胃癌細胞生物學特性的影響
- IGF-1對缺血性腦損傷大鼠神經干細胞增殖、遷移和分化的影響.pdf
- integrin β1對rMSCs增殖和分化影響的初步研究.pdf
- pegfp-n1質粒轉染乳鼠心肌細胞的分布及效率
- 小鼠牙囊細胞的體外培養(yǎng)特征及增殖分化影響因素研究.pdf
- pegfp-n1質粒轉染乳鼠心肌細胞的分布及效率
- 重組質粒pEGFP-N1-apoJ的構建及在大鼠骨髓間充質干細胞中的表達研究.pdf
- IGF-1對胚胎小鼠神經干細胞體外增殖和分化的影響.pdf
- bFGF與IGF1對大鼠睪丸間質細胞再生及睪酮分泌影響的初步研究.pdf
- 大鼠pEGFP-N1-BKβ1真核表達載體的構建及苦杏仁苷對支氣管平滑肌細胞增殖的研究.pdf
- 體外共培養(yǎng)人牙髓干細胞對人牙囊干細胞增殖及成骨分化的影響.pdf
- 外源性IGF-1對外斜視貓內直肌成肌細胞增殖及分化的影響.pdf
- TPO、TGFβ1對體外巨核細胞增殖、分化的影響.pdf
- 牙乳頭細胞對大鼠牙髓干細胞增殖及分化的影響及機制研究.pdf
評論
0/150
提交評論