牙囊細胞對健康-炎癥組織來源牙周膜干細胞增殖、分化及干性的影響.pdf

1、PDLSCs因具有較強的自我更新和多向分化能力而被廣泛應用于牙周組織再生中,為了獲得更好的再生效果,尤其是在牙周病微環(huán)境下,PDLSCs多向分化潛能會受到不利的影響而發(fā)生降低,眾多學者紛紛著眼于如何優(yōu)化PDLSCs的生物學特性。DFCs是牙周組織中的間充質(zhì)干細胞,也是一種發(fā)育期的前體細胞,以往很多研究主要集中于DFCs的多向分化潛能。鑒于共培養(yǎng)的方式可以模擬體內(nèi)微環(huán)境,促進兩種細胞間的相互作用,而DFCs和PDLSCs在牙齒發(fā)育過程中具

2、有十分密切的關(guān)系,本實驗設立DFCs和H/PPDLSCs的共培養(yǎng)體系,假設DFCs能夠提供一種良好的微環(huán)境,使處于其中的H/PPDLSCs的生物學特性得到優(yōu)化,以期獲得更好的牙周再生效果。實驗分為三部分:
　　1.DFCs、H/PPDLSCs的培養(yǎng)、鑒定及共培養(yǎng)系統(tǒng)的建立
　　目的:獲得實驗所需的三種細胞,并分別建立DFCs和HPDLSCs、PPDLSCs的共培養(yǎng)體系。方法:分別從健康牙周組織和牙周病患者的牙周組織獲得HPD

3、LSCs和PPDLSCs,從青少年處于牙胚狀態(tài)的智齒獲得DFCs,對三種細胞進行原代培養(yǎng),純化后采用流式細胞術(shù)進行間充質(zhì)干細胞表面標記物的鑒定,并利用克隆形成實驗和成骨成脂實驗對HPDLSCs和PPDLSCs進行增殖和多向分化能力的鑒定;最后利用transwell小室建立DFCs和HPDLSCs、PPDLSCs的共培養(yǎng)系統(tǒng)。結(jié)果:健康以及患牙周病的牙周組織均可以獲得PDLSCs,青少年牙囊組織可以獲得DFCs。這三種細胞CD146、CD

4、105、CD90、CD29均呈強陽性表達,而CD45呈陰性表達,說明本實驗獲得的HPDLSCs、PPDLSCs及DFCs為間充質(zhì)來源的干細胞;增殖分化實驗提示PPDLSCs較HPDLSCs克隆形成能力強,而成骨成脂能力弱,提示牙周病的不利微環(huán)境影響了PDLSCs的功能;共培養(yǎng)系統(tǒng)中DFCs和PDLSCs生長良好,共培養(yǎng)系統(tǒng)得以成功建立,為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。
　　2.DFCs對H/PPDLSCs自我更新能力的影響
　　目的:

5、探索DFCs對HPDLSCs、PPDLSCs的自我更新能力(包括干性和增殖能力)的影響。方法:在共培養(yǎng)系統(tǒng)建立后,利用RealTimeRT-PCR檢測下層PDLSCs干性相關(guān)基因Sox2、Oct4、Klf4的表達;利用克隆形成實驗和細胞周期實驗檢測與DFCs共培養(yǎng)后HPDLSCs、PPDLSCs的克隆形成率的變化和細胞周期中處于G2+S期的細胞百分比的改變。結(jié)果:在與DFCs共培養(yǎng)后,HPDLSCs、PPDLSCs中Sox2、Oct4、

6、Klf4的基因水平均發(fā)生明顯上調(diào);克隆形成率也得到了很大程度的增加;而細胞周期結(jié)果顯示HPDLSCs和PPDLSCs中處于G2+S期的細胞百分比顯著增多;其中PPDLSCs各項指標上調(diào)幅度明顯高于HPDLSCs。結(jié)論:與DFCs共培養(yǎng)不同程度的增加了HPDLSCs、PPDLSCs的自我更新能力。
　　3.DFCs對H/PPDLSCs多向分化能力的影響
　　目的:評估與DFCs共培養(yǎng)之后對HPDLSCs、PPDLSCs的多向分

7、化能力(包括成骨、成脂能力)的影響。方法:在建立與DFCs的共培養(yǎng)系統(tǒng)后分別對其進行成骨成脂誘導實驗,誘導后進行ALP染色和ALP活性檢測觀察共培養(yǎng)后HPDLSCs、PPDLSCs的ALP活性的改變;利用RealTimeRT-PCR檢測成骨基因Runx2、OCN、ALP的表達和成脂基因PPARγ的表達;采用WesternBlot檢測Runx2蛋白水平的變化;對共培養(yǎng)后HPDLSCs、PPDLSCs分別進行茜素紅染色和油紅O染色以觀察礦化

8、結(jié)節(jié)和脂滴的形成情況。結(jié)果:在與DFCs共培養(yǎng)后HPDLSCs、PPDLSCs的ALP活性均得到明顯增強;Runx2、OCN、ALP、PPARγ基因水平也發(fā)生了大幅上調(diào),Runx2蛋白變化趨勢與基因結(jié)果一致;茜素紅和油紅O染色結(jié)果顯示DFCs增加了HPDLSCs、PPDLSCs形成礦化結(jié)節(jié)和脂滴的數(shù)量;PPDLSCs的成骨成脂能力上調(diào)幅度顯著高于HPDLSCs。結(jié)論:DFCs從不同程度優(yōu)化了HPDLSCs、PPDLSCs的成骨成脂分化能