二-（6-羥基-4-氧代-4H-苯并吡喃-3-基）-乙二亞胺在HeLa細(xì)胞中上調(diào)p53的凋亡作用.pdf

1、背景：人乳頭瘤狀病毒 (Human Papillomavirus，HPV)感染是宮頸癌的主要病因。HPV編碼的E6蛋白與p53蛋白和細(xì)胞內(nèi)的E6相關(guān)蛋白(E6 associated protein，E6-AP)結(jié)合，經(jīng)過泛素途徑使p53降解，使正常細(xì)胞發(fā)生癌變，形成惡性腫瘤。p53的細(xì)胞內(nèi)活性作用是維持遺傳的穩(wěn)定性，這主要體現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞周期的阻滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和DNA修復(fù)。MDM2蛋白是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)p53濃度及活性的重要蛋白質(zhì)，兩者構(gòu)成似電

2、流環(huán)路中的負(fù)反饋，彼此相互進(jìn)行精細(xì)的調(diào)節(jié)。MDM2以介導(dǎo)p53穿過核膜進(jìn)入胞漿降解和對(duì)p53轉(zhuǎn)錄活性的直接抑制作用兩種形式實(shí)現(xiàn)對(duì)p53功能的調(diào)節(jié)。黃酮類化合物(flavonoids compounds)是植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛地存在于自然植物中，結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜多樣，表現(xiàn)出多種多樣的藥理活性，能防治心腦血管系統(tǒng)的疾病和呼吸系統(tǒng)的疾病，具有抗炎抑菌，降血糖，抗氧化，抗輻射，抗癌，抗腫瘤以及增強(qiáng)免疫能力等藥理作用。黃酮類化合物已成為目前新藥開發(fā)

3、的熱點(diǎn)。 方法：用新合成的黃酮希夫堿二-(6-羥基-4-氧代-4H-苯并吡喃-3-基)-乙二亞胺 (bis(6-hydroxy-4-OXO-4H-chromene-3-yl)-ethylenediimine， B6)在不同濃度下對(duì)Hela細(xì)胞處理不同時(shí)間。采用SRB、臺(tái)盼藍(lán)染色、檢測(cè)化合物對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用；在相差顯微鏡下觀察化合物的作用所引起的細(xì)胞形態(tài)的改變；用AO/EB雙染，觀察細(xì)胞的凋亡形態(tài)：瓊脂糖凝膠電泳，化合物作

4、用的細(xì)胞DNA形成條帶；透射電鏡觀察細(xì)胞形成的凋亡小體；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Hela細(xì)胞的凋亡以及細(xì)胞周期的阻滯；Westem Blot檢測(cè)p53、MDM2蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果： SRB法檢測(cè)到24h對(duì)Hela細(xì)胞的IC<,50>為43.51μmol/L，；臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)到化合物24h對(duì)Hela細(xì)胞有明顯的抑制作用；相差顯微鏡和AO/EB雙染紫外激發(fā)熒光顯微鏡下均觀察到細(xì)胞質(zhì)膜分離，細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)亡小體；瓊脂糖凝膠電泳紫外激發(fā)下可以觀察

5、到DNA在180～200bp間形成梯狀條帶；透射電鏡下看到細(xì)胞染色質(zhì)固縮、分離并沿核膜分布，細(xì)胞質(zhì)亦發(fā)生固縮，細(xì)胞凋亡前體；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞被阻滯在G1期，細(xì)胞發(fā)生凋亡，調(diào)亡率在0μmol/L、40μmol/L、80μmol/L濃度時(shí)分別為0.05﹪，6.1﹪，8.6﹪；Western Blot檢測(cè)p53蛋白的量隨化合物濃度增加而增加，MDM2蛋白的量隨p53蛋白的量增加而增加。以上結(jié)果說明該化合物能夠誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡，促進(jìn)p